本文選題：Caveolin-1 + 多藥耐藥��； 參考：《鄭州大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：食管癌是我國高發(fā)的惡性腫瘤之一,其中河南省太行山區(qū)林州市人群中的食管癌發(fā)病率位居世界首位。我國食管癌以食管鱗癌為主,侵襲性強(qiáng),預(yù)后差,臨床進(jìn)展迅速,多伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,且易復(fù)發(fā),5年生存率僅為10%左右。Caveolin-1(Cav-1)是胞膜窖標(biāo)志性蛋白質(zhì)之一,主要通過腳手架結(jié)構(gòu)域(Caveolin-1 Scaffording Domain,CSD)、跨膜結(jié)構(gòu)域以及Y14位點(diǎn)等與其它蛋白相互作用,來調(diào)節(jié)多種信號傳導(dǎo)分子和通路的活性,從而影響細(xì)胞的分化、增殖、遷移和凋亡等。不少研究表明,Cav-1在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腫瘤生成和轉(zhuǎn)移等病理過程中起著非常重要的作用,其不僅在多種腫瘤中表達(dá)異常,而且在不同腫瘤中具有不同的作用和機(jī)制。如在乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌中Cav-1呈低表達(dá)狀態(tài),可能是人類腫瘤抑制因子;而在前列腺癌、膀胱癌中Cav-1則過度表達(dá),充當(dāng)癌基因的作用。目前,Cav-1及其調(diào)控的下游信號傳導(dǎo)途徑已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn),Cav-1在癌旁組織及食管鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)量升高,具有促進(jìn)食管鱗癌發(fā)生的作用,但目前鮮少有Cav-1與ESCC多藥耐藥之間相關(guān)性的研究報(bào)道。因此為彌補(bǔ)該方面研究的欠缺,本實(shí)驗(yàn)對食管鱗狀細(xì)胞癌組織、癌旁組織及正常食管組織中Cav-1、P53、BDNF、P-gp、MRP1和β-catenin的表達(dá)進(jìn)行檢測,分析食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生過程中Cav-1與五者間的相關(guān)性;采用cav-1基因超表達(dá)方法進(jìn)一步提高Cav-1食管鱗癌細(xì)胞Ec9706中的表達(dá),分析Cav-1的高表達(dá)對癌細(xì)胞多藥耐藥性相關(guān)蛋白表達(dá)和藥物外排的影響;最后采用sh RNA干擾技術(shù)抑制Ec9706細(xì)胞中cav-1基因的表達(dá),進(jìn)一步檢測Cav-1的降低表達(dá)對食管鱗癌細(xì)胞多藥耐藥性蛋白表達(dá)和藥物外排的影響。上述研究不僅為食管癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究提供新的思路和為其臨床治療提供新的靶點(diǎn),還可為降低ESCC患者多藥耐藥性提供科學(xué)依據(jù)。第一部分Caveolin-1及多藥耐藥相關(guān)蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及相關(guān)性分析方法1.免疫組織化學(xué)法檢測86例食管鱗狀細(xì)胞癌組織、癌旁組織和癌旁正常食管粘膜組織中Cav-1、P53、P-gp、MRP1、β-catenin和BDNF蛋白的表達(dá)情況。2.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:SPSS21.0軟件統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析,兩個(gè)變量之間的相關(guān)性檢驗(yàn)用Spearman相關(guān)分析,兩分類變量的比較用Pearson’sχ2檢驗(yàn);以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示:Cav-1蛋白在癌旁正常食管組織、癌旁組織及食管鱗狀細(xì)胞癌組織中主要分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜,陽性表達(dá)率依次升高,分別為15.11%、38.37%、61.63%,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.多藥耐藥相關(guān)蛋白免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示:MRP1、P-gp、P53蛋白在正常食管組織、癌旁組織及食管鱗狀細(xì)胞癌組織中陽性表達(dá)率依次升高,分別為17.44%、39.53%、63.95%,22.09%、44.18%、72.09%,9.30%、46.51%、59.30%,各蛋白組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。BDNF蛋白在正常食管組織、癌旁組織及食管鱗狀細(xì)胞癌組織中陽性表達(dá)率依次升高,為6.98%、10.47%、18.6%,但各蛋白組間比較無顯著差異(P0.05)。β-catenin蛋白在正常食管組織、癌旁組織及食管鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá),其陽性表達(dá)率基本無變化,但在核質(zhì)中的陽性表達(dá)率分別為8.14%、52.32%、80.23%,有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.經(jīng)SPSS21.0檢驗(yàn)分析,食管鱗癌組織中Cav-1與P-gp、MRP1、P53具有明顯的正相關(guān)性(γ分別為0.77、0.453、0.581;P均為0.000),而與BDNF的表達(dá)相關(guān)性不明顯(γ=0.000;P=0.391);此外,Cav-1的表達(dá)雖與β-catenin的整體表達(dá)沒有明顯的相關(guān)關(guān)系,但與細(xì)胞核質(zhì)表達(dá)的β-catenin有一定的相關(guān)性(γ=0.003;P=0.000)。第二部分Caveolin-1表達(dá)對食管鱗癌細(xì)胞多藥耐藥相關(guān)蛋白的影響方法1.通過超表達(dá)cav-1基因和載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)來研究食管鱗癌細(xì)胞Ec9706中多藥耐藥相關(guān)基因的表達(dá),運(yùn)用RT-PCR和Western blots檢測基因超表達(dá)是否成功和RNA干擾效率。2.運(yùn)用RT-PCR和Western blots檢測超表達(dá)cav-1基因和RNA干擾前后Ec9706細(xì)胞中MRP1、P-gp、P53、BDNF、β-catenin的m RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)變化。3.應(yīng)用藥物外排實(shí)驗(yàn)檢測超表達(dá)cav-1基因和RNA干擾前后Ec9706細(xì)胞外排Calcein AM和Rhodamine123的變化,采用熒光顯微鏡拍照。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS21.0軟件統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多個(gè)樣本均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析(One-way ANOVA),Western blots灰度值及熒光強(qiáng)度應(yīng)用Image-Pro Plus6.0進(jìn)行分析。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果1.cav-1基因超表達(dá)和si RNA干擾表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功:與對照組相比,轉(zhuǎn)染后48h和72h超表達(dá)組中cav-1基因m RNA相對表達(dá)量分別為221.46±25.14,290.13±43.36,蛋白質(zhì)相對表達(dá)量為3.19、5.97,表達(dá)量均顯著增加(P0.01)。表明cav-1基因超表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。與對照組相比,轉(zhuǎn)染P3-1和P3-3質(zhì)粒的細(xì)胞中cav-1基因m RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量沒有明顯改變(P0.05),而轉(zhuǎn)染P3-2質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量顯著下降(P0.01),即cav-1基因m RNA相對表達(dá)量降為0.454±0.17,蛋白質(zhì)相對表達(dá)量降為0.52。表明構(gòu)建成功的si RNA質(zhì)粒為P3-2。2.cav-1基因表達(dá)水平改變對ESCC細(xì)胞中多藥耐藥相關(guān)蛋白P-gp、MRP1、P53、BDNF、β-catenin表達(dá)的影響:(1)cav-1基因表達(dá)水平改變對P-gp表達(dá)的影響:cav-1基因超表達(dá)48h和72h的Ec9706細(xì)胞中P-gp m RNA和蛋白相對表達(dá)量為0.84±0.31、0.72±0.20和1.01、0.91,雖然其表達(dá)量有少許降低,但并沒有顯著統(tǒng)計(jì)意義(P0.05);干擾cav-1表達(dá)72h的Ec9706細(xì)胞中P-gp m RNA和蛋白相對表達(dá)量為0.56±0.07、0.71,表達(dá)量顯著降低(P0.05)。(2)cav-1基因表達(dá)水平改變對MRP1表達(dá)的影響:cav-1基因超表達(dá)48h和72h的Ec9706細(xì)胞中MRP1 m RNA和蛋白相對表達(dá)量為1.58±0.18、3.55±0.21和1.76、3.51,表達(dá)量顯著增加(P0.05);干擾cav-1表達(dá)72h的Ec9706細(xì)胞中MRP1 m RNA和蛋白相對表達(dá)量為0.33±0.09、0.62,表達(dá)量顯著降低(P0.05)。(3)cav-1基因表達(dá)水平改變對P53表達(dá)的影響:cav-1基因超表達(dá)48h和72h的Ec9706細(xì)胞中P53 m RNA和蛋白相對表達(dá)量為0.90±0.13、2.30±0.11和1.14、0.95,m RNA表達(dá)量在72h顯著增加(P0.05),但蛋白質(zhì)表達(dá)量幾乎不改變;干擾cav-1表達(dá)72h的Ec9706細(xì)胞中P53 m RNA和蛋白相對表達(dá)量為0.63±0.14、0.42,表達(dá)量顯著降低(P0.05)。(4)cav-1基因表達(dá)水平改變對β-catenin表達(dá)的影響:cav-1基因超表達(dá)48h和72h的Ec9706細(xì)胞中β-catenin m RNA和蛋白相對表達(dá)量為0.98±0.10、1.27±0.07和1.20、0.98,表達(dá)量改變不顯著(P0.05);干擾cav-1表達(dá)72h的Ec9706細(xì)胞中β-catenin m RNA和蛋白相對表達(dá)量為0.92±0.08、0.89,表達(dá)量無明顯改變(P0.05)。(5)cav-1基因表達(dá)水平改變對BDNF表達(dá)的影響:Ec9706細(xì)胞中并沒有檢測到BDNF基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)。在cav-1基因超表達(dá)和降低表達(dá)的Ec9706細(xì)胞中,同樣未檢測到BDNF m RNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。3.細(xì)胞外排Calcein AM和Rhodamine123研究:超表達(dá)cav-1 48h和72h的細(xì)胞中Calcein AM的熒光強(qiáng)度分別為852322.6±211.2、827510.3±1567.5,與對照組細(xì)胞(1364586.8±589.2、1445295.3±1134.6)相比,Calcein AM熒光強(qiáng)度明顯降低(P0.01);相反,與對照組細(xì)胞(434570.1±1854.2、470330.8±3234.6)相比,超表達(dá)cav-1 48h和72h的細(xì)胞中Rhodamine123的熒光強(qiáng)度沒有明顯改變(P0.05),其熒光強(qiáng)度分別為412125±2175.4、403155.4±562.8。cav-1敲低表達(dá)的細(xì)胞中Calcein AM的熒光強(qiáng)度分別為1757270.7±7650.1,與對照細(xì)胞(1293502.9±1729)相比,Calcein AM熒光強(qiáng)度明顯升高(P0.01);同樣,與對照細(xì)胞(464069.4±2256.5)相比,cav-1敲低表達(dá)的細(xì)胞中Rhodamine123的熒光強(qiáng)度亦明顯升高(P0.01),其熒光強(qiáng)度為687517.4±692.7。結(jié)論1.Cav-1、MRP1、P-gp、P53的表達(dá)與食管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),上述四者的表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展;β-catenin的表達(dá)與食管癌變之間無明顯相關(guān)性,但其從細(xì)胞膜到細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)的定位變化可能與食管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。2.食管鱗癌中,Cav-1的表達(dá)分別與P-gp、MRP1、P53表達(dá)具有明顯的相關(guān)關(guān)系,但與BDNF、β-catenin的表達(dá)相關(guān)性不明顯。3.cav-1上調(diào)表達(dá)基本上不影響P-gp和P53 m RNA和蛋白質(zhì)表達(dá),但低表達(dá)可降低P-gp和P53 m RNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平,提示Cav-1在食管鱗癌細(xì)胞中對P-gp和P53表達(dá)的調(diào)節(jié)作用可能存在劑量效應(yīng)。4.食管鱗癌的耐藥性改變與Cav-1表達(dá)水平密切相關(guān):Cav-1表達(dá)水平改變顯著影響多藥耐藥相關(guān)基因和蛋白即P-gp和MRP1的表達(dá)水平,從而改變食管鱗癌細(xì)胞對藥物的外排作用。因此,Cav-1可作為一個(gè)有效的逆轉(zhuǎn)食管鱗癌多藥耐藥的相關(guān)靶點(diǎn)。
[Abstract]:Caveolin - 1 ( Cav - 1 ) plays an important role in the pathogenesis of esophageal squamous cell carcinoma . The expression of P53 , P - gp , MRP1 , 尾 - catenin and BDNF protein were statistically significant ( P0.05 ) . The expression of multidrug resistance related protein in esophageal squamous cell carcinoma cell line Ec9706 was detected by RT - PCR and Western blot . ( 4 ) The relative expression of 尾 - catenin mRNA and protein in Ec9706 cells were 0 . 98 鹵 0 . 10 , 1 . 27 鹵 0 . 07 and 1 . 20 , 0 . 98 respectively . There was no significant correlation between the expression of BDNF mRNA and protein in the cells of cav - 1 and 72 h ( P - gp , MRP1 , P - gp and P - gp ) .

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1

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本文編號：1793541