本文選題：miR-744 + 肺癌��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：背景和目的依據(jù)GLOBOCAN 2012數(shù)據(jù),肺癌仍是最常見及致死率最高的惡性腫瘤。盡管近年來依靠影像技術(shù)和化療藥物的更新在診斷和治療方面取得了進展,但其5年生存率仍然低于20%。肺癌5年生存率停滯不前的主要原因是:(1)早期癥狀不典型,大多數(shù)患者確診時已是中晚期,僅有30%的患者能行根治性手術(shù)切除;(2)極易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移,即使是能行根治性手術(shù)切除的患者亦有50%在5年內(nèi)會出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。(3)EGFR突變和ALK重排的識別在非小細胞肺癌中(NSCLC)開啟了基于基因標(biāo)志選擇合適人群進行個體化治療的時代。然而,EGFR突變和ALK重排僅,分別見于23%和6%的肺腺癌患者。大部分肺癌仍缺乏有效治療,提示我們探究肺癌進展和轉(zhuǎn)移的分子機制,探尋新的干預(yù)靶點,對提高肺癌的治愈率和生存率,延長患者生命有著極其重要的臨床指導(dǎo)意義。microRNA是一類在真核細胞中廣泛存在的長約22個核苷酸的單鏈非編碼小RNA,在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演著促癌或抑癌的雙重角色,參與到腫瘤進展及轉(zhuǎn)移各個環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)。針對肺癌的差異表達芯片分析已發(fā)現(xiàn)十余個與肺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的miRNAs。其中一些miRNAs在非小細胞肺癌中的作用已得到了證實。例如miR-21的高表達與肺癌患者的復(fù)發(fā)及不良預(yù)后相關(guān),且可直接抑制重要的抑癌基因PTEN,促進非小細胞肺癌的生長、侵襲遷移及放化療抵抗,還與EGFR-TKI獲得性耐藥相關(guān)。不僅如此,更重要的是miRNA具有在石蠟標(biāo)本、外周血、痰液、尿等多種標(biāo)本中長期存在的穩(wěn)定性,以及有多基因靶向性,這些自身特性決定了 miRNA在肺癌診斷、分子分型、療效預(yù)測、預(yù)后判斷以及靶向治療等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。這些結(jié)果展示了 miRNA作為腫瘤標(biāo)志物以及肺癌治療靶點的巨大潛能。miR-744是我們前期在肺癌細胞中篩選到的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MTA1干擾后發(fā)生變化的microRNA,我們在預(yù)實驗研究中發(fā)現(xiàn)miR-744在非小細胞肺癌細胞株、組織及血清中表達上調(diào),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān),功能學(xué)實驗顯示miR-744能促進肺癌細胞的侵襲遷移能力,提示miR-744在非小細胞肺癌中發(fā)揮了促癌基因的作用。然而,迄今關(guān)于miR-744在腫瘤領(lǐng)域中的研究為數(shù)不多,因此,深入探討miR-744在非小細胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)功能并闡明其上下游調(diào)控分子機制,對于非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移的預(yù)測、診斷、預(yù)后判斷、干預(yù)及藥物研制均具有重要指導(dǎo)意義。在本研究中,我們擬通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測并結(jié)合文獻報道,篩選出非小細胞肺癌中miR-744靶向c-FOS啟動子區(qū)域,再用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證miR-744通過直接與c-FOS啟動子結(jié)合在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)其表達。并通過一系列體外實驗證實miR-744介導(dǎo)了候選靶基因c-FOS對非小細胞肺癌細胞增殖、侵襲遷移能力的影響。失調(diào)miR-744的表達檢測其對紫杉醇藥物作用細胞抑制生長的影響,并探索失調(diào)miR-744后其對肺癌細胞放射敏感性影響。最后,在非小細胞肺癌組織標(biāo)本中及TCGA數(shù)據(jù)庫證實候選miRNA與c-FOS表達之間的相關(guān)性。材料和方法1.臨床標(biāo)本收集15對原發(fā)性肺癌癌組織及其相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本。所有患者簽署知情同意書,該程序獲得南方醫(yī)院臨床研究倫理委員會的批準(zhǔn)。所有患者術(shù)前都未曾接受放療或化療。所有樣品立即置于-80℃液氮保存,并對癌旁組織及腫瘤組織病理學(xué)分析驗證組織類型。2.數(shù)據(jù)庫挖掘方法從癌癥基因組計劃(TCGA)數(shù)據(jù)庫下載肺癌的分析數(shù)據(jù)集(http://cancergenome.NIH.gov/)[16]。3.細胞系與細胞培養(yǎng)細胞是從美國模式菌種收集中心購買A549和H520(ATCC,美國),和SPC-A-1,H1299細胞由中國科學(xué)院上海細胞庫購買(上海,中國)。所有的培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基(康寧、NY、美國)含10%胎牛血清(FBS、Gibco、南美洲、NY、美國)。所有細胞均于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。4.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-744的前體序列由上海吉凱公司合成并插入GV209載體中,構(gòu)建穩(wěn)定過表達miR-744慢病毒的載體,命名為LV-miR-744。并含無關(guān)序列載體做為對照。將慢病毒轉(zhuǎn)入A549和H520細胞中并經(jīng)嘌呤霉素篩選及qRT-PCR驗證獲得穩(wěn)定過表達miR-744肺癌細胞株。5.寡核苷酸構(gòu)建、瞬時轉(zhuǎn)染antagomir-744,antagomir 陰性對照(antagomir-NC),agomir-744,agomir陰性對照(agomir-NC)的設(shè)計合成由銳博生物科技提供(廣州市,中國)。si-c-fos和si-control的設(shè)計合成由吉瑪生物公司提供(上海,中國)。瞬時轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine TM 3000 說明書進行操作,A549,SPC-A-1,H1299 和 H520 肺癌細胞培養(yǎng)在6孔板中,轉(zhuǎn)染48或72小時后進行后續(xù)試驗。6.RNA提取及熒光定量PCR從肺癌細胞和組織中提取總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA,根據(jù)SYBR Green法進行熒光定量PCR。7.細胞生物學(xué)試驗[1]CCK8實驗:用來表示細胞生長抑制率。[2]平板克隆實驗:用來檢測放療敏感性。[3]Edu細胞增殖檢測:熒光顯微鏡下計數(shù)Edu陽性細胞數(shù),用來表示細胞增殖。[4]劃痕實驗:不同時間點檢測細胞的遷移率。[6]遷移和侵襲實驗:于顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù),表示腫瘤細胞遷移、侵襲能力。8.動物實驗-皮下及轉(zhuǎn)移瘤模型[1]動物皮下瘤實驗:將 antagomir-744 干擾的 A549/mir-744,和 antagomir-NC對照組A549/control分別接種于5只裸鼠左、右側(cè)后背部皮下,每側(cè)4x 106細胞。同樣的,將穩(wěn)定過表達miR-744的H520/miR-744和對照組H520/control分別接種于5只裸鼠。[2]肺轉(zhuǎn)移瘤模型:將穩(wěn)定過表達miR-744的A549/miR-744和對照組A549/control 及穩(wěn)定過表達 miR-744 的 H520/miR-744 和對照組 H520/control分別注射入裸鼠尾靜脈中,2x106細胞/只,5只/組。30天后整體可視化觀察肺部轉(zhuǎn)移情況,進行活體成像后,將裸鼠處死,取出肺組織HE染色后,光學(xué)顯微鏡觀察計數(shù)轉(zhuǎn)移瘤個數(shù)。9.雙熒光素酶活性檢測按照Dual-Luciferase(?)Reporter Assay System說明書操作,將轉(zhuǎn)染后的細胞于酶標(biāo)儀上分別測定Fireflyluciferase和Renilla luciferase的活性,以pRL-TK質(zhì)粒作為內(nèi)參,計算上述兩熒光素酶活性的比值,比較不同樣品間的差異。10.Western blot提取細胞總蛋白,用BCA法測定蛋白濃度,然后經(jīng)蛋白變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、免疫雜交、顯影后,采用Quantity One軟件進行蛋白表達相對定量。11.統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。qRT-PCR各細胞株相對表達量采用Brown-Forsythe法;CCK8生長曲線比較采用析因設(shè)計的方差分析;體內(nèi)外功能實驗采用兩獨立樣本t檢驗。miR-744與c-FOS表達的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)。所有數(shù)據(jù)均進行3次獨立重復(fù)實驗,數(shù)值以均數(shù)±SE來表示。P0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.miR-744在肺癌中的表達及臨床意義TCGA肺癌數(shù)據(jù)分析,以ROC曲線法將樣本分成miR744高表達(n=237)組和低表達組(n=219),顯示miR744的表達與肺癌生存相關(guān)高表達組vs低表達組(p=0.0016)。進一步分析顯示miR744在肺鱗癌與腺癌的表達量不同(p=0.007)。COX風(fēng)險模型分析顯示鱗癌中miR744高表達預(yù)后差(HR,2.685;95%CI,1.596-4.517;P = 0.000)。qRT-PCR 結(jié)果顯示,與 HBE 相比,miR-744 在 95D,A549,H1299,H520肺癌細胞株中呈不同程度表達上調(diào);在15例肺癌組織中,miR-744的平均表達水平比對應(yīng)癌旁組織提高(fold difference = 2.053,P = 0.0329)。表明miR-744在肺癌中可能是一個促癌基因。2.miR-744在肺癌細胞中的生物學(xué)功能研究和藥物敏感性,放療敏感性檢測選取人肺癌細胞株A549,SPC-A-1,H1299和H520作為細胞模型,通過miR-744表達失調(diào)的體內(nèi)外功能實驗,研究miR-744在肺癌細胞中的生物學(xué)功能。首先,瞬時轉(zhuǎn)染miR-agomir或antagomir后可顯著上調(diào)或下調(diào)miR-744的表達。其次,通過Transwell遷移侵襲,劃痕,EDU實驗觀察到miR-744表達改變對肺癌細胞功能的影響顯著。在此結(jié)果基礎(chǔ)上,將antagomir-744干擾的A549和對照組A549/control分別接種于裸鼠,至第26天,A549/antagomir-744細胞所形成的腫瘤體積較對照細胞減小(t=5.9002,P=0.0029),且腫瘤的平均重量亦較對照細胞下降(t=39.1112,P=0.0013)。相反的,將穩(wěn)定過表達 miR-744 的 H520/miR-744 和對照組H520/control分別接種于裸鼠,差異同樣顯著。構(gòu)建持續(xù)過表達miR-744的細胞株A549/miR-744及H520/miR-744,建立裸鼠尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型。結(jié)果表明,實驗組肺轉(zhuǎn)移瘤大且數(shù)量較多,與對照組相比,實驗組的肺轉(zhuǎn)移明顯增高(P=0.0306 和 P=0.0283)。此外紫衫醇藥物實驗顯示,一定范圍濃度內(nèi),隨著濃度的遞增,對A549細胞的增殖抑制作用逐漸增強;當(dāng)化療藥物聯(lián)合antagomir-744后,抑制作用比單純化療藥物具有上升趨勢。紫杉醇單藥的IC50為5.191nmol/L,當(dāng)聯(lián)合antagomir-744 后,IC50 降至 4.104nmol/L(下降 20.94%),P=0.029;當(dāng)化療藥物聯(lián)合過表達miR-744后,抑制作用比單純化療藥物具有下降趨勢。紫杉醇單藥的IC50為4.961nmol/L,當(dāng)聯(lián)合744后,IC50升至5.943nmol/L(上升19.79%),P=0.036。同樣,H520的藥物實驗結(jié)果也顯示明顯趨勢。分別對A549和H520細胞照射OGY,2GY,4GY,6GY,8GY后繪制存活曲線顯示過表達miR-744細胞存活分數(shù)明顯高于對照組細胞,干擾miR-744細胞細胞存活分數(shù)明顯低于對照組細胞。以上結(jié)果顯示,miR-744參與了肺癌的進展及轉(zhuǎn)移過程,其表達失調(diào)與肺癌細胞的體內(nèi)外增殖及轉(zhuǎn)移密切相關(guān),在肺癌中起著促癌基因的作用。3.miR-744促進肺癌細胞侵襲遷移的分子機制目前,c-FOS已被證實能促進多種腫瘤細胞的增殖遷移侵襲。通過qRT-PCR及WB檢測miR-744失調(diào)后的肺癌細胞株A549,SPC-A-1,H1299和H520中c-FOS mRNA和蛋白的表達,我們發(fā)現(xiàn)miR-744過表達后可顯著上調(diào)肺癌細胞株中c-FOS mRNA和蛋白的表達,而抑制則表達降低。利用RNAhybrid miRanda、TargetScan軟件預(yù)測miR-744的靶基因,并未發(fā)現(xiàn)miR-744存在靶向c-FOS3'UTR的結(jié)合位點,而利用RNAhybrid我們發(fā)現(xiàn)miR-744在c-FOS的啟動子區(qū)存在4個可能結(jié)合位點(Site 1,-1227 to-1195;Site 2,-358 to-332;Site 3,-323 to-298;Site 4,-221 to-192)。因此,我們將含有預(yù)測結(jié)合位點的c-FOS的啟動子區(qū)克隆到報告基因載體pGL3中,檢測熒光素酶活性,過表達miR-744比對照組使細胞中pGL3-c-FOS的熒光素酶活性提高。而后構(gòu)建相應(yīng)預(yù)測結(jié)合位點的突變序列,Site 1和Site 3熒光素酶活性明顯下降,表明miR-744與c-FOS的site 1和Site 3可特異性結(jié)合�；谝陨辖Y(jié)果,我們分別將si-c-FOS及si-c-FOS-NC與agomir-744及agomir-NC共轉(zhuǎn)染后進行功能回復(fù)實驗。通過qRT-PCR及Western blot檢測我們發(fā)現(xiàn),與對照組相比,上調(diào)miR-744能升高c-FOS基因及蛋白水平的表達,干擾c-FOS能顯著降低c-FOS基因及蛋白水平的表達,而共轉(zhuǎn)染si-c-FOS及agomir-744后可部分逆轉(zhuǎn)agomir-744對c-FOS基因及蛋白水平表達的影響。此外,我們還進行了 Transwell遷移實驗和Boyden侵襲實驗,進一步從功能實驗證實miR-744對肺癌細胞遷移和侵襲能力的影響是通過調(diào)控c-FOS實現(xiàn)的。結(jié)論1.miR-744在肺癌組織和細胞株中表達上調(diào),且與肺癌的生存相關(guān)。2.miR-744參與了肺癌的發(fā)病及轉(zhuǎn)移機制,其表達失調(diào)可影響肺癌細胞的體內(nèi)外增殖和轉(zhuǎn)移能力,藥物敏感性,放療敏感性,扮演著癌基因的角色。3.在肺癌中,c-FOS為miR-744的靶基因,miR-744通過直接靶向c-FOS啟動子促進其轉(zhuǎn)錄從而促進肺癌細胞遷移和侵襲。進一步驗證miR-744與MAPK通路相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

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本文編號：1783911