發(fā)布時(shí)間：2018-04-21 03:05

  本文選題：甲狀腺乳頭狀癌 + BRAF突變5hmC　； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：甲狀腺癌占甲狀腺結(jié)節(jié)的7%-15%,是最常見的內(nèi)分泌腫瘤。其中甲狀腺乳頭狀癌占有越來越大的比例,鑒于當(dāng)前的患者數(shù)量,且該數(shù)量仍在迅速增加,需要制定有效診治甲狀腺癌的策略。常規(guī)的臨床病理學(xué)評(píng)估是目前為甲狀腺癌患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層的基礎(chǔ),主要臨床病理因素包括患者年齡、性別、腫瘤直徑、腺外侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和晚期腫瘤。但上述傳統(tǒng)臨床病理指標(biāo)并不能有效精準(zhǔn)地識(shí)別侵襲性較高的甲狀腺癌。當(dāng)前針對(duì)甲狀腺乳頭狀癌的最佳預(yù)測(cè)指標(biāo)及診治指南仍存在爭(zhēng)議,在這種情況下,針對(duì)分子機(jī)制以及分子靶向藥物領(lǐng)域的研究便有了巨大的進(jìn)步。BRAF突變是甲狀腺癌中常見的體細(xì)胞突變,在約45%的甲狀腺乳頭狀癌中發(fā)生此突變。BRAF可以激活MEK引起下游MAPK通路產(chǎn)生效應(yīng)。但BRAF發(fā)揮作用的途徑也許不只是通過堿基突變等常規(guī)遺傳學(xué)改變,近年來越來越多的研究將重點(diǎn)放在表觀遺傳學(xué)修飾上。表觀遺傳學(xué)修飾能產(chǎn)生可遺傳的基因表達(dá)或細(xì)胞表型的變化,且不會(huì)對(duì)DNA序列產(chǎn)生影響。DNA甲基化是當(dāng)前研究最廣泛的表觀遺傳修飾,一般發(fā)生在Cp G位點(diǎn)基因中,然而在富含胞嘧啶和鳥嘌呤的Cp G島則反而未被甲基化,而大部分基因表達(dá)的啟動(dòng)子就位于此區(qū)域,暗示甲基化和腫瘤之間存在相關(guān)性。5m C是基因組中最豐富的Cp G修飾,其通常與基因沉默相關(guān)。而TET家族的發(fā)現(xiàn)以及其催化生成的5m C氧化產(chǎn)物,使得關(guān)于這種表觀遺傳學(xué)修飾的研究越來越多,其逆轉(zhuǎn)DNA甲基化以及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄功能的作用漸漸被發(fā)現(xiàn)。本研究選取50例患者納入研究,將患者臨床病理特征匯總后與BRAF測(cè)序結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)BRAF~(V600E)突變與腺外侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素相關(guān)。隨后將5hm C染色結(jié)果與臨床病理特征也進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)5hm C羥甲基化水平作為臨床指標(biāo)的特異度及靈敏度更高,初步提示了5hm C作為臨床預(yù)測(cè)指標(biāo)的價(jià)值,并引導(dǎo)本研究繼續(xù)探討去甲基化在乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。在新鮮組織中,本研究從DNA水平通過斑點(diǎn)雜交發(fā)現(xiàn)甲狀腺乳頭狀癌基因組DNA的5hm C水平明顯升高,進(jìn)而通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白質(zhì)電泳從RNA及蛋白質(zhì)水平發(fā)現(xiàn),調(diào)控5hm C代謝的羥甲基化酶TET家族中的TET3表達(dá)升高。在體外實(shí)驗(yàn)中,本研究通過小分子干擾RNA阻遏TET3在甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系TPC-1及B-CPAP中的表達(dá),免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明TET3表達(dá)降低可使羥甲基化水平降低,同時(shí)CCK-8、Transwell及劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TET3降低后甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力下降。由于TPC-1和B-CPAP分別為BRAF野生型和BRAF~(V600E)突變型細(xì)胞系,兩組細(xì)胞系之間結(jié)果并無明顯差異,說明TET3發(fā)揮其去甲基化作用進(jìn)而影響細(xì)胞功能,并不受BRAF突變的影響,其表觀遺傳學(xué)修飾與堿基突變分別從不同水平對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。CRISPR/Cas系統(tǒng)是原核生物的免疫系統(tǒng),通過獲得免疫的形式給予原核生物抵抗外源性遺傳物質(zhì)的能力,通過對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行改造,將人工合成的g RNA與Cas9核酸酶的復(fù)合物轉(zhuǎn)入細(xì)胞后,可以在指定基因組位點(diǎn)進(jìn)行切割,從而實(shí)現(xiàn)基因的敲除或引入,這種方法可以簡(jiǎn)單高效地靶向基因組中的特定DNA序列,從而能夠快速發(fā)現(xiàn)新的基因功能、開發(fā)新的細(xì)胞和動(dòng)物疾病模型,并且在腫瘤治療領(lǐng)域取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。本研究將CRISPR/Cas9應(yīng)用于甲狀腺乳頭狀癌中,探究羥甲基化酶TET影響甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的機(jī)制。首先利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立TET3穩(wěn)定敲除的BRAF野生型甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞系,并向這株細(xì)胞中過表達(dá)野生型BRAF。TET3敲除組TPC-1細(xì)胞與對(duì)照組相比,其去甲基化水平、侵襲、增殖和遷移能力均有不同程度的降低,而當(dāng)在TET3敲除組TPC-1細(xì)胞中過表達(dá)BRAF后,可以觀察到腫瘤細(xì)胞的侵襲、增殖和遷移能力都有一部分回復(fù)。與此同時(shí),本研究在BRAF突變型細(xì)胞系B-CPAP中重復(fù)上述試驗(yàn)并觀察到相同的結(jié)果。Ch IP-q PCR分析發(fā)現(xiàn)TET3可以結(jié)合到野生型和突變型BRAF基因的啟動(dòng)子區(qū),調(diào)控BRAF的表達(dá)。說明TET3促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中,至少部分依賴于BRAF的活性。
[Abstract]:In this study , 50 patients with thyroid papillary carcinoma have been identified as the most abundant epigenetic modification of thyroid carcinoma . In this study , we used the CRISPR / Cas9 technique to establish the novel gene function , develop new cell and animal disease models , and observe the same results .

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R736.1

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本文編號(hào)：1780635