本文選題：乳腺癌 + microRNA��； 參考：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：【研究背景】腫瘤是威脅人類健康的重大疾病,而我國(guó)的癌癥負(fù)擔(dān)不斷增加,每年大約有160萬人被診斷為癌癥,約120萬人死于癌癥。乳腺癌是目前女性最常見的惡性腫瘤之一,它發(fā)病率高,死亡率高。全球乳腺癌的發(fā)病率自20世紀(jì)70年代以來一直呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì),而且近年來發(fā)病年齡趨于年輕化。但是隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的不斷提高,近年來乳腺癌的五年生存率有了很大的提高,但是有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者的愈后仍然很差,五年生存率大約為20%。每年大約有30%的乳腺癌患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,其中有70%左右都是骨轉(zhuǎn)移。侵襲性生長(zhǎng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的最主要的原因。盡管,目前的研究成果有利于我們進(jìn)一步了解乳腺癌的發(fā)生發(fā)展,但是仍然有很多尚未發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記物阻礙了我們對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的全面認(rèn)識(shí)。越來越多的研究表明,microRNA在癌癥的診斷和治療中發(fā)揮著重要的作用,在乳腺癌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾十種可以影響腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的microRNA。mi RNA是一類長(zhǎng)度約20~24個(gè)核苷酸的非編碼小RNA,是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA。它們通過與靶基因的m RNA3’UTR區(qū)結(jié)合,抑制蛋白質(zhì)的合成或直接降解靶m RNA,從而調(diào)控基因的表達(dá)。目前,只有一小部分的mi RNA的生物學(xué)功能得到了闡明。miR-205是一種被證實(shí)的對(duì)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有著重要負(fù)調(diào)控作用的抑癌基因,有研究報(bào)道m(xù)iR-205在前列腺癌等腫瘤組織中低表達(dá),而恢復(fù)miR-205在前列腺癌中的表達(dá),可以導(dǎo)致間質(zhì)樣細(xì)胞向上皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。我們前期基因芯片分析發(fā)現(xiàn),miR-205在乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá),于是我們想進(jìn)一步研究它的生物學(xué)功能。腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)是實(shí)體瘤惡性進(jìn)展的先決條件,其中會(huì)涉及到許多靶基因的表達(dá)異常和功能缺失。Runx2,又稱核心結(jié)合因子,已有研究證明在多種惡性腫瘤中扮演者癌基因的功能。我們思考miR-205-3p-3p的下降在乳腺癌進(jìn)展中是否起到了促進(jìn)作用?而這其中miR-205-3p-3p是否與Runx2有一定的聯(lián)系呢?本課題中,首先檢測(cè)了正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和乳腺癌細(xì)胞MB231、MCF7中miR-205-3p-3p的表達(dá)水平,人為改變miR-205-3p-3p的表達(dá)水平觀察乳腺癌細(xì)胞在增殖、遷移侵襲以及克隆形成的變化;并通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和熒光素酶報(bào)告基因來驗(yàn)證Runx2是否為miR-205-3p的靶基因。通過探討miR-205-3p在乳腺癌細(xì)胞中的作用,為乳腺癌的臨床診斷和治療提供了新的方向�！狙芯磕康摹刻接憁iR-205-3p在乳腺癌細(xì)胞中的作用,尋找其靶基因�！狙芯�?jī)?nèi)容】miR-205-3p在乳腺癌細(xì)胞株中的作用以及miR-205-3p與靶基因Runx2的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證1.用qRT-PCR檢測(cè)人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和乳腺癌細(xì)胞MB231、MCF-7中,miR-205-3p的表達(dá)情況。2.用慢病毒感染三株細(xì)胞,建立穩(wěn)定表達(dá)miR-205-3p inhibitor/negative control的MCF-10A細(xì)胞株和穩(wěn)定表達(dá)miR-205-3p mimic/negative control的MB231、MCF-7細(xì)胞株。3.用上述構(gòu)建好的細(xì)胞株來研究miR-205-3p在乳腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能。(1)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化(2)平板克隆實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MB231和MCF-7的克隆形成能力和非錨定生長(zhǎng)能力。(3)Transwell法檢測(cè)MCF-10A、MB231和MCF-7中細(xì)胞侵襲能力的改變。4.用Western blot檢測(cè)與EMT相關(guān)marker的蛋白表達(dá)情況。5.檢測(cè)miR-205-3p是否通過Wnt/β-catenin介導(dǎo)EMT。6.用Targetscan軟件預(yù)測(cè)miR-205-3p的靶基因Runx2,并用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來驗(yàn)證。7.通過PCR和Western blot檢測(cè)抑制或過表達(dá)miR-205-3p后Runx2的變化�！狙芯拷Y(jié)果】1.與人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A相比,miR-205-3p在乳腺癌細(xì)胞MB231、MCF-7中低表達(dá)。2.成功構(gòu)建了敲低miR-205-3p的MCF-10A和過表達(dá)miR-205-3p的MB231、MCF-7穩(wěn)定細(xì)胞株。3.miR-205-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖速度的影響:MTT結(jié)果顯示,在MCF-10A中敲低miR-205-3p的表達(dá)后,細(xì)胞增殖速度明顯增加;而在MB231和MCF-7中過表達(dá)miR-205-3p后,細(xì)胞的生長(zhǎng)速度受到了抑制。4.miR-205-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞克隆形成能力和非錨定生長(zhǎng)能力的影響:平板克隆結(jié)果顯示,在MB231和MCF-7中過表達(dá)miR-205-3p后,克隆形成的大小和克隆形成率明顯減少,軟瓊脂的集落形成大小和個(gè)數(shù)也都明顯減少,表明miR-205-3p抑制了乳腺癌細(xì)胞的克隆形成能力和非錨定生長(zhǎng)能力。5.miR-205-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響:Tranwell結(jié)果表明,在在MCF-10A中敲低miR-205-3p的表達(dá)后,細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng);而在MB231和MCF-7中過表達(dá)miR-205-3p后,細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱。以上結(jié)果表明了miR-205-3p的升高能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。6.miR-205-3p與MET的關(guān)系:細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),在MB231中過表達(dá)miR-205-3p后,細(xì)胞間的連接變得緊密。通過WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn),間質(zhì)樣Marker的表達(dá)降低,而上皮樣Marker表達(dá)升高。7.miR-205-3p在乳腺癌細(xì)胞中可以通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生。8.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件分析Runx2的m RNA 3’UTR區(qū)與miR-205-3p有一段完全互補(bǔ)的堿基序列;通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)將Runx2的野生型質(zhì)粒與miR-205-3p mimic共轉(zhuǎn)到293T細(xì)胞中,熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比顯著降低,驗(yàn)證了Runx2是miR-205-3p的一個(gè)靶基因。9.過表達(dá)或抑制miR-205-3p在MB231和MCF-10A中的表達(dá),Runx2的m RNA和蛋白水平相應(yīng)的出現(xiàn)下降或上升�！窘Y(jié)論】在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-205-3p,能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和克隆形成能力,同時(shí)能夠逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生,在乳腺癌中發(fā)揮著抑癌基因的作用。
[Abstract]:Breast cancer is one of the most common malignant tumors in breast cancer . The expression of miR - 205 - 3P in breast cancer cell line MCF - 10A and breast cancer cells MB231 and MCF - 7 were determined by using the above - mentioned construction cell line . The expression of miR - 205 - 3P in MCF - 10A and MCF - 7 was significantly reduced compared with control group . The results showed that miR - 205 - 3P inhibited the invasion ability of breast cancer cells .

【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.9

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本文編號(hào)：1771622