本文選題：乳腺癌 + Neogenin��； 參考：《吉林大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：乳腺癌是女性最常見惡性腫瘤之一,嚴(yán)重危及女性生命健康。盡管乳腺癌早期診斷和治療的方法在不斷更新,但是乳腺癌仍然穩(wěn)居全世界女性癌癥相關(guān)死亡原因的首位。早期檢測(cè)和發(fā)現(xiàn)是提高乳腺癌患者生存率的至關(guān)重要因素,通過分子生物學(xué)方法對(duì)腫瘤發(fā)生過程中異常表達(dá)的基因進(jìn)行研究、尋找腫瘤特異的分子生物學(xué)標(biāo)記,在乳腺癌早期診斷和個(gè)體化治療的靶點(diǎn)選擇中有重要意義。Neogenin是一種在生物體各組織中廣泛表達(dá)的I型跨膜糖蛋白,由1461個(gè)氨基酸編碼,分子量為160-190k Da,屬于結(jié)直腸癌缺失蛋白(deleted in colorectal cancer,DCC)家族和免疫球蛋白超家族的成員。Neogenin蛋白與配體結(jié)合后,參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo),在生物體胚胎發(fā)育和成體各組織的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。此外,Neogenin在配體缺失的情況下,可以作為依賴性受體發(fā)揮作用,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Neogenin在哺乳動(dòng)物的胚胎中和成體的各個(gè)組織中表達(dá)很廣泛,不僅促進(jìn)胚胎的發(fā)育,在哺乳動(dòng)物成體的神經(jīng)管發(fā)育、細(xì)胞遷移、組織發(fā)育和組織分化、血管形成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞調(diào)亡過程也發(fā)揮重要作用。近年的研究發(fā)現(xiàn),DCC家族的成員在腫瘤中可以發(fā)揮抑癌因子的作用;同時(shí),在包括腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌在內(nèi)的多個(gè)腫瘤中,也發(fā)現(xiàn)了Neogenin基因的異常表達(dá),這些研究結(jié)果提示Neogenin可能在這些腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。另有研究發(fā)現(xiàn),通過特定條件誘導(dǎo)衍生的同一來源、侵襲能力不同的三種乳腺癌細(xì)胞,隨著乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的增強(qiáng),Neogenin的表達(dá)呈降低趨勢(shì)。這些研究結(jié)果提示Neogenin在乳腺癌中可能發(fā)揮抑癌因子的作用,并可能作為預(yù)后判定的一個(gè)指標(biāo)。然而,Neogenin在乳腺癌組織中表達(dá)情況,Neogenin是否與乳腺癌的發(fā)生、進(jìn)展有關(guān),以及對(duì)于臨床乳腺癌患者Neogenin表達(dá)的臨床意義,國(guó)內(nèi)外尚無相關(guān)研究及報(bào)道。在本研究中,首先通過Real-time PCR和Western blot方法檢測(cè)乳腺上皮細(xì)胞系和乳腺癌細(xì)胞系中Neogenin的表達(dá)趨勢(shì);隨后,通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù),在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中過表達(dá)Neogenin,并分析其對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和細(xì)胞周期等方面的影響,探討Neogenin在乳腺癌中的作用和分子機(jī)制;此外,采用免疫組織化學(xué)染色和Real-time PCR檢測(cè)了54例乳腺導(dǎo)管癌及配對(duì)癌旁組織中Neogenin的表達(dá)情況,并與乳腺癌預(yù)后相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室及臨床指標(biāo)進(jìn)行比較、分析之間的相關(guān)性,探討對(duì)于乳腺癌患者Neogenin表達(dá)的臨床意義,肯定了Neogenin作為乳腺癌個(gè)體化治療潛在靶點(diǎn)的地位。實(shí)驗(yàn)方法:1.培養(yǎng)正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A、乳腺癌MCF-7、BT-549和MDA-MB-231細(xì)胞,Real-time PCR和Western blot檢測(cè)以上四株細(xì)胞中Neogenin m RNA和蛋白的表達(dá)水平。2.通過脂質(zhì)體將pc DNA3.1-e GFP-Neogenin質(zhì)粒和pc DNA3.1-e GFP空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。采用Real-time PCR和Western blot對(duì)Neogenin過表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。3.通過CCK8法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、PI法檢測(cè)細(xì)胞周期、TUNEL法觀察上調(diào)Neogenin表達(dá)后,MDA-MB-231細(xì)胞在增殖和凋亡方面的變化,并通過Real-time PCR檢測(cè)增殖、凋亡相關(guān)基因的m RNA表達(dá)水平,探討Neogenin對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡產(chǎn)生影響的分子機(jī)制。4.通過細(xì)胞劃痕法、Boyden小室法觀察上調(diào)Neogenin表達(dá)后,MDA-MB-231細(xì)胞在遷移和侵襲能力方面的變化,并通過Real-time PCR檢測(cè)遷移和侵襲相關(guān)基因的m RNA表達(dá)變化,探討Neogenin對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲產(chǎn)生影響的分子機(jī)制。5.免疫組織化學(xué)染色和Real-time PCR法檢測(cè)54例乳腺導(dǎo)管癌組織和配對(duì)癌旁組織中Neogenin蛋白及m RNA的表達(dá)情況。根據(jù)臨床及病理資料分析Neogenin基因在乳腺癌患者中的表達(dá)與乳腺癌患者臨床指標(biāo)、病理指標(biāo)、預(yù)后指標(biāo)的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示:與正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A相比,Neogenin在三種乳腺癌細(xì)胞株中的m RNA及蛋白的表達(dá)均降低;且Neogenin的表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。2.熒光顯微鏡、Real-time PCR和Western blot結(jié)果證實(shí):pc DNA3.1-e GFP-Neogenin質(zhì)粒和pc DNA3.1-e GFP空載質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染并獲得了較高的轉(zhuǎn)染效率,在MDA-MB-231細(xì)胞中有效上調(diào)了Neogenin m RNA和蛋白的表達(dá)。3.上調(diào)Neogenin后MDA-MB-231細(xì)胞的增殖受到抑制、細(xì)胞周期G1→S期的進(jìn)程延緩、細(xì)胞凋亡比率增高。Real-time PCR結(jié)果顯示上調(diào)Neogenin后,凋亡抑制基因Bcl-2和c-Myc表達(dá)水平明顯下降,而CTGF、Med19、RPL13、Jun B、Suvivin表達(dá)水平無明顯變化(p0.05)。4.上調(diào)Neogenin后MDA-MB-231細(xì)胞的遷移及侵襲能力受到抑制。Real-time PCR結(jié)果顯示上調(diào)Neogenin后,促進(jìn)遷移和侵襲的Vimentin、MMP-2和MMP-9基因的m RNA表達(dá)水平明顯下降,而抑制遷移和侵襲的TIMP3基因的m RNA的表達(dá)水平升高(p0.05)。5.Neogenin在人乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義5.1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:1Neogenin在54例癌旁組織中為中等強(qiáng)度的表達(dá),表達(dá)部位位于細(xì)胞膜;2Neogenin在54例乳腺癌組織中,13例為陰性(24.1%)、35例為弱陽性(64.8%)、6例為中度陽性(11.1%),在乳腺癌組織中的表達(dá)部位位于胞漿。5.2 Real-time PCR結(jié)果顯示:與配對(duì)癌旁組織相比,乳腺癌組織中Neogenin的m RNA表達(dá)水平下降者占94.4%(51/54),表達(dá)升高者僅占5.6%(3/54)。將各自配對(duì)的癌旁組織中Neogenin的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為1,Neogenin在54例乳腺癌組織中的相對(duì)表達(dá)量的平均值為0.264±0.0330,Neogenin在乳腺癌組織中表達(dá)下降(p0.05)。5.3 Neogenin與乳腺癌病理組織分級(jí)的關(guān)系:病理組織分級(jí)II級(jí)的乳腺癌Neogenin的m RNA相對(duì)定量平均值為0.330±0.034,III級(jí)為0.192±0.031,二者具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。Neogenin的m RNA表達(dá)水平與乳腺癌病理組織分級(jí)呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。5.4 Neogenin與乳腺癌預(yù)后相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)系:根據(jù)54例乳腺癌樣本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的生物學(xué)標(biāo)記將患者分組。1ER陰性組Neogenin表達(dá)水平更低(0.221±0.029 vs.0.309±0.036);2PR陰性組Neogenin表達(dá)水平更低(0.256±0.034vs.0.279±0.031);3 HER-2陽性組Neogenin表達(dá)水平更低(0.239±0.029 vs.0.281±0.035);4 Ki67陽性組Neogenin表達(dá)水平更低(0.256±0.033 vs.0.287±0.035);5 p53陰性組Neogenin表達(dá)水平更低(0.237±0.030 vs.0.308±0.037)。但上述結(jié)果差異不顯著。5.5 Neogenin與乳腺癌臨床預(yù)后指標(biāo)的關(guān)系:根據(jù)54例乳腺癌患者的臨床資料將患者分組。1老年性乳腺癌組Neogenin表達(dá)水平更低(以65歲為老年界限:0.042±0.003 vs.0.270±0.032)(以60歲為老年界限:0.141±0.020 vs.0.278±0.033);2腫瘤直徑20mm組Neogenin表達(dá)水平更低(0.237±0.028 vs.0.298±0.037);3無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Neogenin表達(dá)水平最低為0.164±0.025,(1~3枚淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組:0.379±0.035,4~9枚淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組:0.258±0.035,≥10枚淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組:0.330±0.038);4 TNM分期I期Neogenin表達(dá)水平最低為0.206±0.319(II期:0.292±0.322,III期:0.254±0.357,IV期:0.302±0.368);5脈管神經(jīng)浸潤(rùn)組Neogenin表達(dá)水平更低(0.247±0.026 vs.0.272±0.035);6Luminal A型乳腺癌Neogenin表達(dá)水平最高為0.407±0.400,H型乳腺癌中最低為0.199±0.236(Lumianl B型:0.217±0.314;三陰性乳腺癌:0.244±0.356)。由于樣本例數(shù)原因,上述結(jié)果差異并不顯著。結(jié)論:1.Neogenin在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)降低,且Neogenin的表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力呈負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)。提示Neogenin可能作為乳腺癌轉(zhuǎn)移能力預(yù)測(cè)的指標(biāo)。2.乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)Neogenin后,抑制了細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力,阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)展、促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。提示Neogenin表達(dá)上調(diào)可能對(duì)乳腺癌起到抑制作用,Neogenin在乳腺癌中可能發(fā)揮抑癌因子的作用。3.Neogenin可能通過抑制Bcl-2、c-Myc基因的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡;Neogenin可能通過抑制MMP-2、MMP-2、Vimentin基因的表達(dá)并促進(jìn)TIMP-3基因的表達(dá),抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲,但具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。4.Neogenin在乳腺癌組織中表達(dá)降低,與乳腺癌病理組織學(xué)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)(P0.05)。Neogenin在老年性乳腺癌、淋巴結(jié)陰性乳腺癌、I期乳腺癌中表達(dá)降低,在Luminal A型乳腺癌中表達(dá)最高。提示Neogenin可能參與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的過程,為Neogenin作為乳腺癌預(yù)后判定因素提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9

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本文編號(hào)：1770869