本文選題：G蛋白 + GNG7　； 參考：《中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：有絲分裂和膜轉(zhuǎn)運異常是導(dǎo)致惡性腫瘤等疾病發(fā)生和發(fā)展的重要因素。近年來的證據(jù)表明,這兩個看似相對獨立的關(guān)鍵生命過程之間存在著某種緊密聯(lián)系。然而至今,在有絲分裂和膜轉(zhuǎn)運中起雙重調(diào)控功能的蛋白及其調(diào)控機制研究相對匱乏,因此發(fā)現(xiàn)更多的、在兩過程中均起關(guān)鍵調(diào)控功能的蛋白對于闡明腫瘤等疾病的發(fā)病機理有重要的指導(dǎo)意義。本文分別從高爾基體蛋白STK16激酶和Gγ蛋白GNG7入手,聯(lián)合細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等手段,深入探究兩者在有絲分裂和膜轉(zhuǎn)運中的功能及調(diào)控機制,獲得的主要研究結(jié)果如下:1.高爾基體蛋白STK16在有絲分裂和膜轉(zhuǎn)運中的功能研究STK16激酶主要定位于高爾基體和細(xì)胞膜上。高爾基體部分的STK16在間期時與高爾基體的中間膜囊標(biāo)記蛋白Giantin共定位,而有絲分裂期時定位發(fā)生變化。STK16干擾或活性抑制后不僅推遲細(xì)胞進(jìn)入分裂期,導(dǎo)致G2期細(xì)胞比例增高,而且細(xì)胞在分裂期的持續(xù)時間延長,前中期細(xì)胞和胞質(zhì)分裂期細(xì)胞也大幅度增多。并且,STK16干擾或活性抑制后影響高爾基體在G2期和分裂前期的片段化,以及分裂后期高爾基體的重組裝。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),STK16激酶可以與肌動蛋白actin直接結(jié)合,并以濃度依賴型和激酶活性依賴型形式調(diào)控actin的聚合和解聚動力學(xué)。因此,STK16激酶能直接通過調(diào)節(jié)actin的動態(tài)平衡影響高爾基體形態(tài)并調(diào)控細(xì)胞的有絲分裂進(jìn)程。VSVG-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染顯示,STK16并不影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體以及高爾基體到細(xì)胞質(zhì)膜之間的順式轉(zhuǎn)運。然而,STK16卻參與了經(jīng)典的胞吞、鐵轉(zhuǎn)運蛋白的胞內(nèi)循環(huán)以及表皮生長因子受體的降解途徑;并且,STK16在細(xì)胞質(zhì)膜和早期內(nèi)體、以及高爾基體和內(nèi)體之間的膜轉(zhuǎn)運以及自噬中發(fā)揮功能。定點突變結(jié)果表明,肉豆蔻酰化和棕櫚�；揎検荢TK16定位于細(xì)胞質(zhì)膜和高爾基體的前提;兩種修飾均可作用于STK16對actin的聚合動力學(xué)的調(diào)控、高爾基體形態(tài)和蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑刺激下的核質(zhì)穿梭,提示STK16可能作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控其他基因的表達(dá)和功能。2. G蛋白GNG7在有絲分裂和自噬中的功能研究報道顯示,Gy亞基成員GNG7在幾種腫瘤細(xì)胞中低表達(dá);通過半定量RT-PCR檢測,我們也發(fā)現(xiàn)GNG7在多種腫瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄本水平顯著低于正常細(xì)胞,表明GNG7可能是一個抑癌蛋白。因此,在GNG7低表達(dá)的骨肉瘤和宮頸癌細(xì)胞中過表達(dá)GNG7蛋白,并比較生長曲線的變化,結(jié)果表明GNG7過表達(dá)后不僅細(xì)胞生長被抑制,而且細(xì)胞大量死亡。進(jìn)一步結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞周期同步化以及RNA干擾等技術(shù),探討GNG7抑制細(xì)胞生長的機制。結(jié)果顯示,GNG7過表達(dá)和干擾均使細(xì)胞阻滯于分裂期,導(dǎo)致大量雙核/多核細(xì)胞的產(chǎn)生/出現(xiàn);并且,GNG7在分裂期特別是分裂后期高表達(dá),這些均提示GNG7可能主要作用于胞質(zhì)分裂期。在此基礎(chǔ)上,分析GNG7對細(xì)胞骨架微絲的影響,結(jié)果表明GNG7可通過調(diào)控體內(nèi)actin的動態(tài)平衡導(dǎo)致胞質(zhì)分裂異常。通過流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞染色和免疫印跡等技術(shù)檢測了 GNG7促進(jìn)細(xì)胞死亡的途徑。結(jié)果顯示,GNG7過表達(dá)會促進(jìn)細(xì)胞凋亡和自噬。通過免疫共沉淀,篩選獲得了自噬過程中與GNG7存在相互作用的蛋白,哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTOR。進(jìn)一步實驗結(jié)果表明,GNG7還可作用于mTOR信號通路進(jìn)而誘導(dǎo)自噬,其干擾會明顯抑制mTOR抑制劑和EBSS饑餓引起的自噬潮變化。因此,GNG7對細(xì)胞生長的抑制和對自噬性死亡的誘導(dǎo)效應(yīng)使其呈現(xiàn)出良好的抑癌效果。一方面,本研究首次發(fā)現(xiàn)定位于高爾基體上的絲氨酸/蘇氨酸激酶可與actin直接相互作用,并能通過調(diào)控高爾基體的形態(tài)和功能影響整個有絲分裂期,為絲氨酸/蘇氨酸激酶家族在細(xì)胞分裂中的調(diào)控模式提供了借鑒;并且,STK16參與多條膜轉(zhuǎn)運途徑;另一方面,GNG7作為第一個被發(fā)現(xiàn)的參與細(xì)胞自噬的Gγ亞基,可與mTOR相互作用并正調(diào)控自噬,并可通過影響actin作用于有絲分裂。因此,STK16和GNG7作為調(diào)控有絲分裂和膜轉(zhuǎn)運的樞紐蛋白,其作用機制研究為兩大生命過程的緊密聯(lián)系提供了有力的證據(jù),也為下一步更深入地探討奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Mitosis and membrane transport abnormality is the leading cause of cancer occurrence and development of important factors. In recent years, the evidence shows that there is a close relationship between these two seemingly independent key life process. However, in mitosis and membrane transport of protein and study of its regulation mechanism of dual control function relatively scarce, therefore found more, in the two plays key regulatory proteins have important guiding significance to clarify the pathogenesis of tumor and other diseases. This paper from the Golgi protein STK16 kinase and G protein of GNG7 gamma, combined with cell biology, biochemistry and molecular biology methods, exploring both in have the function of mitosis and membrane transport and regulation mechanism, the main results are as follows: 1. Golgi protein STK16 in mitosis and membrane transport in function research The STK16 kinase is localized in the Golgi and cell membrane. STK16 Golgi part in interphase Golgi membrane vesicles and intermediate marker protein Giantin co localization, and mitosis orientation changes.STK16 interference or inhibition not only delayed cell mitosis, resulting in increased the percentage of cells in G2 phase, and in the duration of mitotic cell elongation, prometaphase cells and cytokinesis are increased greatly. And the inhibition of STK16 activity after the effect of interference or the Golgi apparatus in G2 phase and prophase of fragmentation and re assembly after the split phase Golgi. Further studies showed that STK16 kinase can directly bind with actin actin kinetics of polymerization and depolymerization, and in a concentration dependent and kinase activity dependent regulation of actin form. Therefore, STK16 kinase can directly regulate actin through the dynamic balance. Ring Golgi morphology and cell mitosis process.VSVG-GFP plasmid transfection showed that STK16 does not affect the CIS transport between the endoplasmic reticulum to the Golgi and Golgi to plasma membrane. However, STK16 is involved in the classical endocytosis, iron transport protein intracellular loop and the degradation pathway of epidermal growth factor receptor STK16; and, in early endosomes and plasma membrane, and membrane transport between the Golgi and endosome and autophagy in function. The results showed that point mutation, myristoylation and palmitoylation modification is the premise of STK16 localized in the cell membrane and the Golgi apparatus; regulation of two kinds of modified STK16 can effect on polymerization kinetics on actin, Golgi morphology and protein transport inhibitor stimulated nucleocytoplasmic shuttling, suggesting that STK16 may act as a transcription factor regulating other gene expression and function of.2. G protein GNG7 The function study reported in mitosis and autophagy, Gy subunit members of low expression of GNG7 in several tumor cells; by semi quantitative RT-PCR assay, we also found that the transcription of GNG7 in tumor cells in the level was significantly lower than that of normal cells, suggesting that GNG7 may be a tumor suppressor protein. Therefore, overexpression of GNG7 protein in osteosarcoma and cervical cancer cells with low expression of GNG7, and compare the changes of the growth curve, the results show that overexpression of GNG7 only after the cell growth was inhibited, and cell death. Further combined with flow cytometry, cell cycle synchronization and RNA interference technology, to explore the mechanism of GNG7 inhibition of cell growth. Showed that GNG7 overexpression and interference are the cell cycle arrest in mitosis, resulting in a large number of binuclear / coenocyte production /; and GNG7 in mitotic anaphase especially high expression, which suggested that GNG7 May be a major role in cytokinesis. On this basis, analyze the influence of GNG7 on microfilament cytoskeleton. The results show that the GNG7 can control the body dynamic balance by abnormal cytokinesis in actin. By flow cytometry, cell staining and Western blot of GNG7 promotes cell death pathway. The results showed that GNG7 overexpression promote cell apoptosis and autophagy. By immunoprecipitation, the proteins interacting with GNG7 in the process of autophagy screening, mammalian target of rapamycin mTOR. further experimental results show that GNG7 can also act on mTOR signaling pathway and induce autophagy, which can inhibit the interference caused by mTOR and EBSS inhibitors of autophagy changes. So the tide of hunger and the inhibition of GNG7 on cell growth and induced autophagic cell death of the cancer showed a good inhibitory effect. On the one hand, this is the first study That is localized in the Golgi serine / threonine kinase can directly interact with actin, and through the morphological and functional regulation of Golgi affects mitosis, as a serine / threonine kinase family in the regulation of cell division provides reference; and STK16, involved in a number of other membrane transport pathway; GNG7, as the first to be found in autophagy G gamma subunit interacts with mTOR and positive regulation of autophagy, and can affect the actin effect of Yu Yousi split. Therefore, STK16 and GNG7 as the control terminal protein fiber splitting and membrane transport, to study its mechanism for two life process the close contact provides strong evidence also laid a foundation for more in-depth discussion.

【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R730.2

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本文編號：1767063