本文選題：47kDa + Anxa7��； 參考：《大連醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：背景:原發(fā)性肝癌是由肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤。其發(fā)病率在消化系統(tǒng)腫瘤中占第三位,全球每年有25萬人,我們國家有11萬人死于肝癌。目前其首選的治療方法為根治性手術(shù)切除,但是術(shù)后五年的復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率仍然居高不下,預(yù)后極差,從診斷到死亡平均生存期為1-4月。遷徙和轉(zhuǎn)移能力是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)行為之一,淋巴道轉(zhuǎn)移是上皮組織來源惡性腫瘤早期轉(zhuǎn)移的主要方式,在原發(fā)性肝癌中,淋巴道轉(zhuǎn)移占7.45%。本研究所選用的Hca/A2(Hca-P)細(xì)胞和Hca/16A3(Hca-F)細(xì)胞是來源于同一親本的細(xì)胞株,卻具有不同轉(zhuǎn)移能力的小鼠肝癌腹水型細(xì)胞。Hca-F細(xì)胞具有高淋巴道轉(zhuǎn)移能力,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約大于75%,而Hca-P細(xì)胞具有低淋巴道轉(zhuǎn)移能力,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約小于25%。本課題組前期研究已利用抑制性消減雜交技術(shù)、基因芯片技術(shù)、定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等,篩選出了Hca-F細(xì)胞和Hca-P細(xì)胞差異性表達(dá)的基因,在Hca-F細(xì)胞中有21個高表達(dá),而在Hca-P細(xì)胞中僅有3個高表達(dá)。如膜聯(lián)蛋白A7(Annexin A7,Anxa7)等,Anxa7基因在Hca F細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于Hca P細(xì)胞。前期研究已發(fā)現(xiàn)這些基因可能與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)。惡性腫瘤的發(fā)生,是腫瘤細(xì)胞分裂與細(xì)胞凋亡平衡失調(diào)所致,這種平衡的紊亂可以發(fā)生在腫瘤細(xì)胞凋亡的任何環(huán)節(jié)當(dāng)中。體內(nèi)和體外的研究均提示,凋亡在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。很多學(xué)者研究提示,Anxa7的異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的形成、遷徙及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因而,對肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移潛能的相關(guān)Anxa7基因及蛋白質(zhì)的研究,有助于闡明肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的機制,為臨床應(yīng)用提供新的治療思路。Anxa7有兩種表達(dá)亞型,分別為47k Da和51k Da,51k Da亞型蛋白在成熟肌組織中較為常見,而腦和心臟中兩種亞型均存在。本實驗選擇以低淋巴道轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞株為研究對象,通過下調(diào)Anxa7基因表達(dá)后,確定何種亞型Anxa7對Hca-P凋亡、增殖及遷徙有影響,并探索該亞型參與調(diào)控相關(guān)凋亡蛋白及其通路的機制。目前研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞凋亡存在三條主要通路:內(nèi)源性線粒體通路、外源性死亡受體通路及內(nèi)源性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路途徑。在不同的凋亡通路中有多種蛋白參與調(diào)控凋亡。研究發(fā)現(xiàn),Bcl-2家族在細(xì)胞線粒體凋亡通路中發(fā)揮重要作用,Bcl-2家族的表達(dá)和調(diào)控是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。Bcl-2屬于抗凋亡蛋白,有抑制細(xì)胞凋亡的作用,而Bax是促凋亡蛋白,有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。Caspase是一類蛋白酶家族,成員較多,可分為3個亞族:Caspase-1、4、5、11屬于Caspase-1亞族;Caspase-2、9屬于Caspase-2亞族;Caspase-3、6、7、8、10屬于Caspase-3亞族。它們的活性位點均包含半胱氨酸殘基,可以選擇性地切割某些蛋白質(zhì),從而造成細(xì)胞凋亡。死亡受體為腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族成員的跨膜蛋白受體,主要由Fas/Fas L介導(dǎo),進(jìn)而活化caspase-8,形成Fas、Fas L、caspase-8構(gòu)成的蛋白復(fù)合體,其作用與線粒體途徑形成的凋亡小體相似,具有裂解并活化caspase-3的作用,引起細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生。本實驗通過下調(diào)47k Da Anxa7表達(dá)后,檢測Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase 8、Caspase 12、Fas、Fas-L及Cytochrome C凋亡相關(guān)蛋白的改變,進(jìn)而揭示47k Da Anxa7參與的凋亡通路。此外本實驗還通過采用線粒體膜電位、免疫共沉淀及WB等方法,進(jìn)一步驗證47k Da Anxa7參與的凋亡通路及相關(guān)凋亡蛋白的分布與改變。目的:1.構(gòu)建p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Anxa7和p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-NC表達(dá)載體,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至低淋巴道轉(zhuǎn)移細(xì)胞株Hca-P細(xì)胞中,得到Pd細(xì)胞、Pdn細(xì)胞。2.研究小鼠肝癌P、Pdn及Pd細(xì)胞組中,47k Da與51k Da Anxa7在三組細(xì)胞中不同亞細(xì)胞定位及表達(dá)的變化。3.研究小鼠肝癌Hca-P細(xì)胞47k Da Anxa7基因表達(dá)水平下調(diào)后,P、Pdn及Pd細(xì)胞組凋亡及遷徙能力的變化。4.研究小鼠肝癌Hca-P細(xì)胞47k Da Anxa7基因表達(dá)水平下調(diào)后,P、Pdn及Pd細(xì)胞組細(xì)胞增殖能力及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Cytochrome-C、Caspase-3、Bax、Caspase-12、Fas、Fas L、Caspase-8的表達(dá)變化。5.研究小鼠肝癌Hca-P細(xì)胞47k Da Anxa7基因表達(dá)水平下調(diào)后,Anxa7參與的凋亡通路相關(guān)機制的探索。方法:1.構(gòu)建p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-Anxa7和p GPU6/GFP/Neo-sh RNA-NC表達(dá)載體,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至Hca-P細(xì)胞,獲得Pd、Pdn,P細(xì)胞為陰性對照。2.應(yīng)用QRT PCR在m RNA水平驗證,Hca-P細(xì)胞在Anxa7基因表達(dá)水平表達(dá)下調(diào)。3.應(yīng)用Western blot在蛋白質(zhì)水平驗證,47k Da與51k Da Anxa7表達(dá)水平表達(dá)下調(diào)。4.采用亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,將P、Pdn及Pd細(xì)胞組進(jìn)行亞細(xì)胞組分的提取,并用WB方法對不同亞細(xì)胞組分中47k Da與51k Da Anxa7基因兩種亞型進(jìn)行定位和表達(dá)對比。5.利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的變化;應(yīng)用Transwell小室檢測細(xì)胞遷徙能力的變化;利用CCK-8實驗檢測細(xì)胞增殖能力的改變。6、應(yīng)用Western blot檢測三組細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Fas-L、Fas、Cytochrome-C、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-12凋亡相關(guān)蛋白的變化。6、應(yīng)用流式細(xì)胞儀,檢測細(xì)胞線粒體膜電位的變化。7、應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)檢測與Anaxa7共沉淀的蛋白;采用亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,并用Western blot方法對各個亞細(xì)胞組分中Bcl-2進(jìn)行定位和表達(dá)比較。結(jié)果:1.表達(dá)載體成功構(gòu)建;并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至Hca-P細(xì)胞。2.Real time q RT-PCR結(jié)果驗證,Hca-P細(xì)胞Anxa7基因表達(dá)水平明顯下調(diào)。3.Western blot結(jié)果驗證,47k Da Anxa7在Pd細(xì)胞組中蛋白表達(dá)水平較P細(xì)胞組及Pdn細(xì)胞組明顯降低(P0.05),而在P與Pdn細(xì)胞組間無明顯差異(P0.05);亞細(xì)胞定位及表達(dá)顯示,在Anxa7基因表達(dá)下調(diào)后,47k Da Anxa7在P與Pdn細(xì)胞組中同時表達(dá)于細(xì)胞漿與線粒體;而51k Da Anxa7主要表達(dá)于線粒體。4.流式細(xì)胞儀檢測47k Da Anxa7基因表達(dá)下調(diào)后,Pd細(xì)胞凋亡明顯高于P細(xì)胞和Pdn細(xì)胞(P0.05),P細(xì)胞和Pdn細(xì)胞之間無明顯差異(P0.05)。細(xì)胞遷徙實驗檢測Pd細(xì)胞細(xì)胞遷徙能力明顯低于P細(xì)胞和Pdn細(xì)胞(P0.05),P細(xì)胞和Pdn細(xì)胞之間無明顯差異(P0.05)。CCK-8增殖實驗檢測結(jié)果提示三組細(xì)胞數(shù)量在24小時內(nèi)無顯著差異(P0.05),在24到72小時的過程中,Pd細(xì)胞增殖能力明顯低于P細(xì)胞和Pdn細(xì)胞(P0.05),P細(xì)胞和Pdn細(xì)胞增殖能力在各時間段無顯著差異(P0.05)。5.47k Da Anxa7基因表達(dá)下調(diào)后Bcl-2在Pd細(xì)胞組明顯低于P細(xì)胞和Pdn細(xì)胞組,有顯著差異(P0.05),Caspase-3、胞漿Cyt-C表達(dá)在Pd細(xì)胞組明顯高于P細(xì)胞和Pdn細(xì)胞組,有顯著差異(P0.05);Bax、線粒體中Cytochrome-C、Caspase-12、Fas、Fas-L及Caspase-8表達(dá)在P細(xì)胞、Pdn細(xì)胞和Pd細(xì)胞組之間無明顯差別(P0.05)。6.線粒體膜電位的變化結(jié)果顯示,下調(diào)47k Da Anxa7表達(dá)的Pd細(xì)胞組線粒體膜電位水平降低P細(xì)胞組和Pdn細(xì)胞組(P0.05);而P細(xì)胞組與Pdn細(xì)胞組之間無明顯差異(P0.05)。7.免疫共沉淀實驗顯示P細(xì)胞組中Anxa7與Bcl-2發(fā)生共沉淀;而未見Anxa7與Bax發(fā)生共沉淀。8.Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn),P細(xì)胞組中47k Da Anxa7與Bcl-2在線粒體與細(xì)胞漿都有表達(dá),51k Da Anxa7僅表達(dá)于線粒體中;在下調(diào)47k Da Anxa7表達(dá)后,Bcl-2在線粒體與細(xì)胞漿的表達(dá)都隨之減少。結(jié)論:1.利用目的基因成功構(gòu)建了表達(dá)載體,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至Hca-P細(xì)胞,獲得Pd細(xì)胞、Pdn細(xì)胞。2.Hca-P細(xì)胞中有47k Da與51k Da Anxa7兩種亞型表達(dá);主要分布于胞漿及線粒體;Pd細(xì)胞中47k Da Anxa7在胞漿及線粒體的表達(dá)均減少。3.47k Da Anxa7具有抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷徙的能力,提示47k Da Anxa7在小鼠肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移機制中起促進(jìn)作用,并參與細(xì)胞凋亡過程。4.47k Da Anxa7主要通過影響抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),并通過線粒體凋亡相關(guān)通路參與凋亡過程。5.47k Da Anxa7介導(dǎo)的凋亡可能與外源性死亡受體凋亡通路及內(nèi)源性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路無關(guān)。6.47k Da Anxa7通過影響Hca-P細(xì)胞線粒體膜電位以及改變Bcl-2蛋白在線粒體與胞漿內(nèi)的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡。7.47k Da Anxa7與Bcl-2發(fā)生共沉淀,未見與Bax發(fā)生共沉淀。8.47k Da Anxa7可以作為腫瘤凋亡治療的一個潛在藥物治療靶點。
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【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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4 ;Identify lymphatic metastasis-associated genes in mouse hepatocarcinoma cell lines using gene chip[J];World Journal of Gastroenterology;2005年10期

5 張曉田;Caspase-3與細(xì)胞凋亡的研究[J];醫(yī)學(xué)綜述;2002年11期

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本文編號：1765762