本文選題：重組質(zhì)粒 + 慢病毒��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中,子宮頸癌(cervical cancer)發(fā)病率居于首位,是最常見的婦科惡性腫瘤,即使在女性全身各系統(tǒng)惡性腫瘤中,其發(fā)病率也僅次于乳腺癌。由于宮頸癌的發(fā)病和HPV感染、社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況等密切相關(guān),所以每年約50萬新病例多數(shù)是在發(fā)展中國(guó)家,我國(guó)約占其中的1/3。近年宮頸癌的發(fā)病呈年輕化趨勢(shì),35歲以下的婦女宮頸癌的發(fā)病率明顯上升。對(duì)于發(fā)現(xiàn)及時(shí)的早期宮頸癌患者,適時(shí)進(jìn)行相應(yīng)的手術(shù)治療,尚能收到不錯(cuò)的臨床預(yù)后,但是對(duì)于比較年輕的宮頸早期癌患者,經(jīng)傳統(tǒng)手術(shù)治療后,陰道、宮頸和子宮等生殖器官解剖結(jié)構(gòu)和功能均受到的不同程度的破壞,使患者的性功能與生育能力受到影響。尋找一種既能夠有效治療宮頸癌,同時(shí)又能盡量最大程度保護(hù)患者性功能和生殖能力的治療手段(Fertility-Sparing Therapy),一直是醫(yī)患雙方的共同期盼。脈沖電場(chǎng)(Pulsed Electric Fields;PEF)是近年來興起的一種新型的腫瘤物理治療方法。通過調(diào)節(jié)電場(chǎng)中脈沖頻率(Frequency)、脈沖個(gè)數(shù)(Pulses)、脈沖波寬度(Pulse Width)、電場(chǎng)強(qiáng)度/電壓(Electric Field Strength/Voltage)等參數(shù),可以生成能發(fā)揮不同生物學(xué)作用的PEF。其中,脈寬在μs級(jí)、場(chǎng)強(qiáng)達(dá)~k V/cm的一種PEF,可以使細(xì)胞表面的磷脂分子重排,細(xì)胞膜上親水性通道形成,微孔無法恢復(fù),對(duì)細(xì)胞膜造成永久性的損傷,即在電場(chǎng)作用后細(xì)胞膜呈高通透狀態(tài),繼而細(xì)胞因?yàn)槟?nèi)外生物大分子、離子等物質(zhì)失衡而死亡,這就被稱為細(xì)胞的不可逆性電穿孔(Irreversible Electroporation;IRE)�；贗RE技術(shù)的腫瘤物理治療儀器“納米刀”系統(tǒng)(Nano Knife?System;Angio Dynamics,NY,USA)已于2011年10月獲美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration;FDA)批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床治療軟組織腫瘤。課題組前期研究表明,IRE體外處理He La細(xì)胞,發(fā)生不可逆性電穿孔而早期壞死的閾值場(chǎng)強(qiáng)為1750V/cm。國(guó)內(nèi)外眾多研究也證實(shí),IRE對(duì)實(shí)體腫瘤的療效確切,現(xiàn)已應(yīng)用于胰腺癌、肝癌、腎癌、前列腺癌、黑色素瘤及軟組織腫瘤等實(shí)體腫瘤的治療,且療效確切,是失去手術(shù)機(jī)會(huì)的腫瘤、或解剖關(guān)系復(fù)雜手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大的腫瘤的二線替代方案之一。IRE通過電極針布陣和調(diào)節(jié)電場(chǎng)參數(shù),治療范圍精確可控;治療時(shí)間短,數(shù)分鐘便可完成治療;且其療效不依賴于熱效應(yīng),不受血流的影響。被認(rèn)為是近年來腫瘤物理治療領(lǐng)域當(dāng)中非常具有應(yīng)用前景的技術(shù)方法之一。IRE的殺傷效應(yīng)雖然與射頻消融(Radiofrequency ablation;RFA)、激光等方法不同,不依賴于熱效應(yīng),但是IRE作用時(shí)隨著電場(chǎng)衰減,周邊殘瘤組織會(huì)受到相對(duì)低能量的脈沖電場(chǎng)作用,這種作用對(duì)腫瘤細(xì)胞惡性行為可能存在潛在的影響。已有研究表明,RFA治療后,如有殘留腫瘤存在,其可能促進(jìn)殘存腫瘤病灶細(xì)胞的增殖、腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移等。IRE消融是否也會(huì)出現(xiàn)類似情況呢?如果確有促進(jìn)作用,那么該如何避免或者處理呢?是否應(yīng)行超范圍消融治療?這些問題在IRE治療研究領(lǐng)域至今未見相關(guān)報(bào)道。因此,本課題構(gòu)建螢火蟲熒光素酶基因(Firefly Luciferase;FLUC)和綠色熒光蛋白基因(Green fluorescent protein;GFP)雙標(biāo)記的He La細(xì)胞系,以此定量分析裸鼠荷瘤模型的殘留腫瘤,進(jìn)而探索IRE后殘留腫瘤生物學(xué)行為的變化。同時(shí),在IRE周圍區(qū)域存在RE區(qū)域,對(duì)于難以避免的殘留腫瘤組織,我們擬充分利用該RE區(qū)域,探索IRE結(jié)合基因治療宮頸癌裸鼠模型的可行性。本課題主要分為以下三個(gè)部分進(jìn)行研究。第一部分LUC/GFP雙標(biāo)記宮頸癌He La細(xì)胞株的構(gòu)建及篩選目的:構(gòu)建LUC/GFP雙報(bào)告基因標(biāo)記的He La細(xì)胞株;方法:將PCR擴(kuò)增得到的LUC基因連接到含有GFP報(bào)告基因的GV218慢病毒載體中,構(gòu)建LUC/GFP雙標(biāo)記的重組質(zhì)粒;將經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證、正確構(gòu)建的重組質(zhì)粒,通過轉(zhuǎn)染、病毒包裝及提純等步驟,收獲一定滴度的病毒原液;用構(gòu)建的LUC/GFP雙標(biāo)記慢病毒轉(zhuǎn)He La細(xì)胞,利用載體上的抗性基因,用嘌呤霉素加壓篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的LUC/GFP-He La細(xì)胞株;采用CCK-8、PI染色測(cè)定細(xì)胞周期及Westernblot等方法檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染是否影響He La細(xì)胞的生物學(xué)行為。結(jié)果:構(gòu)建LUC/GFP雙標(biāo)記的慢病毒,經(jīng)熒光法測(cè)定慢病毒滴度為2.0×109TU/ml;經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染及加壓篩選后,成功構(gòu)建LUC/GFP-He La穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,通過CCK-8、PI染色測(cè)定細(xì)胞周期及Western blot等方法檢測(cè),病毒轉(zhuǎn)染后未改變He La細(xì)胞生物學(xué)行為。結(jié)論:成功構(gòu)建LUC/GFP雙標(biāo)記的慢病毒,經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染及加壓篩選后,成功構(gòu)建LUC/GFP-He La穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,且轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞生物學(xué)行為無明顯變化,可用于構(gòu)建動(dòng)物模型進(jìn)行下一步研究。第二部分IRE后宮頸癌裸鼠模型殘留腫瘤生物學(xué)行為的變化目的:初步探討IRE消融宮頸癌裸鼠模型后殘留腫瘤生物學(xué)行為的變化;方法:使用組織包埋法構(gòu)建皮下移植瘤模型;利用活體動(dòng)物成像技術(shù),探索不同場(chǎng)強(qiáng)的IRE形成殘留腫瘤組織的量效關(guān)系;使用光聲成像技術(shù)測(cè)定IRE處理后即刻腫瘤組織內(nèi)血液供應(yīng)情況;設(shè)立假手術(shù)組、手術(shù)切除組與IRE組進(jìn)行對(duì)照研究,使用活體動(dòng)物成像技術(shù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)殘余腫瘤組織的熒光強(qiáng)度,進(jìn)行定量分析;留取處理前、處理后10天及處理后20天組織樣本,使用Western blot檢測(cè)樣本中與增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白PCNA、VEGF、MMP-9等蛋白的變化。結(jié)果:使用2000V/cm、100μs、1Hz、15個(gè)脈沖劑量的IRE可使荷瘤裸鼠模型殘留部分(53.22±6.28)%腫瘤組織;光聲成像顯示該劑量IRE下留存的部分腫瘤組織內(nèi)有血液供應(yīng);活體動(dòng)物成像熒光強(qiáng)度定量分析顯示,IRE及手術(shù)組處理后24小時(shí),熒光強(qiáng)度分別降低(53.67±5.22)%及(51.81±4.39)%,假手術(shù)組無明顯變化,與預(yù)期相符;處理后10天,手術(shù)組熒光強(qiáng)度較IRE組顯著增加(P0.05);處理后20天,三組熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western blot檢測(cè)腫瘤相關(guān)蛋白結(jié)果顯示,處理后10天,IRE組PCNA表達(dá)明顯低于其他兩組(P0.05),VEGF、E6、MMP-9等無明顯差異(P0.05);處理后20天三組中上述蛋白均無明顯差異。結(jié)論:使用IRE可使荷瘤裸鼠模型殘留部分腫瘤組織,用于下一步研究。IRE處理后短期內(nèi)在一定程度上可抑制殘留腫瘤的增殖,對(duì)殘留腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲等無明顯影響。第三部分IRE介導(dǎo)干擾質(zhì)粒治療殘留腫瘤的可行性研究目的:初步探討IRE在體外及體內(nèi)介導(dǎo)干擾質(zhì)粒進(jìn)入He La細(xì)胞的可行性,以及二者聯(lián)合對(duì)He La細(xì)胞的影響。方法:將HPV18 E6基因特異性干擾序列構(gòu)插入p Genesil-1質(zhì)粒,構(gòu)建HPV 18 E6 sh RNA真核表達(dá)載體;IRE聯(lián)合干擾質(zhì)粒處理He La細(xì)胞株,設(shè)立空白對(duì)照組、IRE處理組、p Genesil-N組、p Genesil-N+IRE組、p Genesil-E6組及和p Genesil-E6+IRE組共6組,使用PCR、Western blot及CCK-8等方法探討聯(lián)合處理對(duì)He La細(xì)胞增殖等生物學(xué)行為的影響;IRE聯(lián)合干擾質(zhì)粒處理裸鼠皮下瘤,48小時(shí)后,使用HE染色了解IRE殺傷效應(yīng),以及快速冰凍切片了解GFP表達(dá)情況;設(shè)立假處理組、IRE組、質(zhì)粒組及IRE+質(zhì)粒組共4組,處理后定期測(cè)量腫瘤體積,了解殘留腫瘤生長(zhǎng)曲線,使用Western blot法檢測(cè)腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:成功構(gòu)建HPV 18 E6 sh RNA真核表達(dá)載體;IRE可介導(dǎo)質(zhì)粒進(jìn)入He La細(xì)胞,處理后48小時(shí)即可見GFP表達(dá);IRE處理聯(lián)合干擾質(zhì)粒處理He La細(xì)胞后,與IRE組比較:E6 m RNA表達(dá)水平顯著下降(P0.05),Western blot提示E6蛋白表達(dá)水平降低(P0.05),P53蛋白表達(dá)水平增高(P0.05)、PCNA表達(dá)水平下降(P0.05);CCK-8法提示:與單純干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較,IRE聯(lián)合質(zhì)粒處理組細(xì)胞增殖活性下降更明顯(P0.05);HE染色證實(shí)所用劑量IRE可致裸鼠皮下瘤部分壞死,殘存部分腫瘤組織;快速冰凍切片顯示,殘留腫瘤內(nèi)可見GFP表達(dá);Western blot提示IRE聯(lián)合質(zhì)�？娠@著抑制殘留腫瘤增殖,對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移等無明顯影響。結(jié)論:IRE在體內(nèi)外均可介導(dǎo)質(zhì)粒進(jìn)入He La細(xì)胞,且聯(lián)合處理可顯著抑制He La細(xì)胞和殘余腫瘤的增殖。IRE聯(lián)合干擾質(zhì)�？勺鳛轭A(yù)防腫瘤殘留的一種新策略。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.33;R-332

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 廖薊;李靜;許興智;;關(guān)于腫瘤生物學(xué)導(dǎo)論課程建設(shè)的思考[J];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2011年06期

2 王易,謝長(zhǎng)宜;“逃逸”與抗“逃逸”——現(xiàn)代腫瘤生物學(xué)治療策略評(píng)述[J];腫瘤;1998年S1期

3 李春海;腫瘤生物學(xué)標(biāo)志研究現(xiàn)狀與展望[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊(cè));2000年01期

4 李春海;腫瘤生物學(xué)標(biāo)志的臨床應(yīng)用與評(píng)價(jià)[J];浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志;2001年07期

5 ;2004亞太地區(qū)國(guó)際腫瘤生物學(xué)暨第21屆國(guó)際腫瘤標(biāo)志學(xué)術(shù)會(huì)議[J];腫瘤防治雜志;2004年01期

6 ;腫瘤生物學(xué)基礎(chǔ)試題答案[J];外科理論與實(shí)踐;2004年04期

7 王茜;冀勇;王長(zhǎng)軍;許鵬;劉勇;葛煦;;腫瘤生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)管理簡(jiǎn)述[J];中國(guó)基礎(chǔ)科學(xué);2007年06期

8 ;2009年亞太地區(qū)腫瘤生物學(xué)和醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議通知[J];中國(guó)肺癌雜志;2009年07期

9 廖薊;許興智;;我國(guó)腫瘤生物學(xué)專業(yè)建設(shè)的思考[J];首都師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2010年06期

10 EJ Freireich;;治療效果對(duì)理解腫瘤生物學(xué)的貢獻(xiàn)[J];醫(yī)學(xué)研究通訊;1987年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前8條

1 呂有勇;;系統(tǒng)腫瘤生物學(xué)與腫瘤的早期防治[A];第三屆中國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)教育論文集[C];2004年

2 胡曉磊;;腫瘤生物學(xué)治療的進(jìn)展[A];浙江省免疫學(xué)會(huì)第六次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2007年

3 詹啟敏;;化學(xué)生物學(xué)在腫瘤生物學(xué)研究和臨床診斷治療中的重要作用[A];第六屆全國(guó)化學(xué)生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

4 盧建;;糖皮質(zhì)激素對(duì)腫瘤生物學(xué)行為的影響極其機(jī)制[A];中國(guó)病理生理學(xué)會(huì)第十三屆腫瘤、第十四屆免疫專業(yè)委員會(huì)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2012年

5 黨亞萍;;腫瘤生物學(xué)特征與正電子顯像劑[A];全國(guó)第九屆核醫(yī)學(xué)電子學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2005年

6 孫潔;付雪瓊;陳歡;張錦;林軍;夏冰;;FACL-4在胃癌中的表達(dá)及其腫瘤生物學(xué)行為[A];第九次全國(guó)消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)會(huì)議專題報(bào)告論文集[C];2009年

7 金英花;宋志光;沈家驄;;細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑的設(shè)計(jì)、合成與腫瘤生物學(xué)中的應(yīng)用[A];“細(xì)胞活動(dòng) 生命活力”——中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)全體會(huì)員代表大會(huì)暨第十二次學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2011年

8 李康安;張貴祥;張峰;趙京龍;李玉潔;胡運(yùn)勝;;MRI監(jiān)測(cè)兔VX2瘤腦脊液源性轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為與VEGF表達(dá)的相關(guān)性研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十三屆全國(guó)放射學(xué)大會(huì)論文匯編（下冊(cè)）[C];2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 王智亮;不可逆電穿孔后宮頸癌裸鼠模型殘留腫瘤生物學(xué)行為變化的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 陳松偉;α-1，3巖藻糖轉(zhuǎn)移酶Ⅳ基因靶向miRNA干擾載體對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的腫瘤生物學(xué)行為的影響[D];廣州醫(yī)學(xué)院;2011年

，

本文編號(hào)：1765205