發(fā)布時間：2018-04-16 16:27

  本文選題：iASPP + 胃癌��； 參考：《重慶醫(yī)科大學》2015年博士論文

【摘要】：背景和目的胃癌的發(fā)生發(fā)展與多種因素相關,如癌基因的激活、抑癌基因的突變或功能抑制等。P53與人類腫瘤關系密切,其野生型可維持細胞正常功能的運行,若其發(fā)生突變則可導致腫瘤的發(fā)生。但約有三分之二的胃癌發(fā)生發(fā)展過程中并未發(fā)生P53的突變,腫瘤細胞是怎樣逃過野生型P53的監(jiān)視發(fā)展而來,其中機制尚不清楚。iASPP為ASPP家族中的一員,可抑制野生型P53的功能,其在多種腫瘤中被認為是癌基因。iASPP在胃癌中的研究較少,曾有報道稱其表達與HP感染有關,但其在胃癌中的作用及其自身調控機制尚無文獻報道。KLF4在胃癌中是一個抑癌基因,胃癌的發(fā)生發(fā)展與KLF4的異常低表達密切相關。KLF4與P53之間存在相互作用,而iASPP是P53抑制蛋白,三者之間存在功能上的聯(lián)系。且基因軟件分析在iASPP啟動子區(qū)存在KLF4的結合序列,推測iASPP與KLF4之間也存在著調控關系。故本研究的主要目的為：明確iASPP在胃癌中的表達情況；探索iASPP在胃癌細胞增殖、凋亡、侵襲及轉移中的作用；探討iASPP與KLF4之間是否存在調控關系。方法1.通過RT-PCR及Western Blot方法檢測癌旁正常胃粘膜組織(20例)、不伴轉移的胃癌組織(20例)、伴有轉移的胃癌組織(20例)、胃癌細胞(MKN45、SGC7901、BGC823)、正常胃粘膜細胞(GES1)中iASPP的表達情況.2.選用iASPP表達水平較高的胃癌細胞株(MKN45、SGC7901),構建并向胃癌細胞株內轉染iASPP的干擾慢病毒,篩選出穩(wěn)定細胞株,然后用Western Blot方法檢測干擾病毒轉染后iASPP的表達情況。3.通過MTT、細胞克隆形成實驗檢測iASPP表達抑制后MKN45及SGC7901的增殖及克隆形成能力；利用流式細胞儀檢測iASPP表達降低前后細胞凋亡的變化；通過Transwell侵襲及遷移實驗檢測MKN45及SGC7901細胞的侵襲及遷移能力的變化。4.構建裸鼠胃癌移植瘤模型,將轉染iASPP干擾慢病毒的MKN45細胞及僅轉染空病毒的MKN45細胞注入裸鼠皮下,觀察裸鼠移植瘤的生長情況。5.通過Western Blot方法檢測KLF4及iASPP在胃癌細胞株(MKN45、SGC7901)及正常胃粘膜細胞(GES1)中的蛋白表達情況,為后續(xù)試驗選擇KLF4及iASPP表達明顯呈負相關的細胞株。6.向所選細胞株(MKN45)內轉染KLF4的過表達質粒并篩選穩(wěn)定細胞株,用Western Blot方法檢測質粒轉染后KLF4的表達情況,并同時檢測iASPP的表達情況,觀察iASPP的表達是否與KLF4的表達相關。向過表達KLF4的穩(wěn)定細胞株內轉染iASPP的過表達質粒,用Western Blot檢測方法檢測iASPP的表達情況。7.通過MTT、細胞克隆形成實驗、流式細胞儀檢測、Transwell實驗檢測KLF4過表達后MKN45細胞的生長增殖、凋亡、侵襲及遷移情況,以及補救實驗(過表達iASPP)后,細胞的生長增殖、凋亡、侵襲及遷移情況的變化。結果1. RT-PCR及Western Blot結果表明,iASPP在胃癌細胞株(MKN45、SGC7901、BGC823)中的表達明顯高于正常胃粘膜細胞(GES1)(P0.05)。與癌旁正常組織相比,iASPP在胃癌組織中的表達水平明顯升高(P0.05),且伴有轉移的胃癌組織中iASPP的表達水平高于不伴轉移的胃癌組織(P0.05).2.根據檢測結果,我們選用iASPP表達水平較高的胃癌細胞株(MKN45、SGC7901)作為后續(xù)試驗對象。熒光顯微鏡觀察結果發(fā)現(xiàn),iASPP干擾慢病毒轉染組的穩(wěn)定細胞株內約有95%以上的細胞有較強的熒光表達。Western Blot結果顯示,轉染了iASPP的干擾慢病毒后,MKN45及SGC7901細胞中iASPP的表達明顯降低(P0.05)。3.MTT及細胞克隆形成實驗表明,抑制iASPP表達可明顯抑制MKN45及SGC7901細胞的增殖及克隆形成能力(P0.05)。流式細胞儀檢測結果顯示,iASPP表達的降低明顯促進了MKN45及SGC7901細胞的凋亡(P0.05)。Transwell實驗結果表明,iASPP表達的降低還抑制了MKN45及SGC7901細胞的遷移及侵襲能力(P0.05)。4.裸鼠移植瘤實驗結果顯示,iASPP干擾組的裸鼠胃癌移植瘤明顯小于對照組(P0.05),且Western Blot驗證了iASPP干擾組的移植瘤內iASPP表達明顯低于對照組。5. Western Blot檢測結果顯示KLF4在MKN45及SGC7901細胞中的表達明顯低于正常胃粘膜細胞GES1 (P0.05),在胃癌細胞MKN45中KLF4及iASPP表達呈明顯負相關,故選用MKN45作為后續(xù)試驗對象。6.在MKN45中轉染KLF4過表達質粒后,KLF4的表達水平明顯升高(P0.05),與此同時,iASPP的表達卻呈降低趨勢(P0.05)。另外,向KLF4過表達的穩(wěn)定細胞株內轉染iASPP的過表達質粒后,iASPP的表達明顯升高(P0.05)7.MTT、細胞克隆形成實驗、流式細胞儀檢測、Transwell實驗結果顯示KLF4在MKN45細胞中的表達升高后明顯抑制了細胞的增殖、侵襲及遷移能力,并促進了細胞的凋亡(P0.05).補救實驗結果表明,iASPP表達的恢復,又重新提高了胃癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力,并抑制了細胞的凋亡(P0.05)。結論1. iASPP在胃癌細胞及胃癌組織中均呈異常高表達,具有癌基因的特性,且其表達水平與胃癌是否伴有轉移密切相關。2.本研究中成功構建和轉染iASPP干擾慢病毒,干擾了iASPP的表達。在胃癌細胞中抑制iASPP的表達后可明顯降低細胞的生長、增殖、侵襲及遷移能力,并促進細胞的凋亡。iASPP表達的降低還可抑制裸鼠體內移植瘤的生長。說明iASPP在胃癌細胞的生長增殖、凋亡、侵襲及遷移過程中發(fā)揮著重要的作用。3.KLF4在胃癌細胞中呈異常低表達,是一個抑癌基因。在胃癌細胞中過表達KLF4后,導致iASPP的表達降低,說明iASPP的表達水平與KLF4的表達有關。4.胃癌細胞中KLF4表達的升高可明顯抑制細胞的增殖、侵襲、遷移能力,并可促進細胞的凋亡。而通過補救實驗,提高iASPP的表達,又恢復了細胞的增殖、侵襲、遷移能力,并抑制了細胞凋亡。故推測KLF4在胃癌中發(fā)揮抑癌作用,是通過抑制iASPP的表達來實現(xiàn)的。5.以往研究表明HP感染可影響iASPP的表達,另外HP感染還可激活Notch信號通路,而Notch信號通路的活化又可抑制KLF4的表達。本研究證實iASPP表達與KLF4相關,且iASPP可抑制P53、P63、P73的功能。故推測HP感染→Notch信號通路活化→KLF4表達降低→iASPP表達升高→P53、P63、P73功能抑制→胃癌的形成。
[Abstract]:BACKGROUND & OBJECTIVE : The development of gastric cancer is related to many factors , such as the activation of oncogene , the mutation of tumor suppressor gene or the inhibition of function . P53 is closely related to human tumor .
To explore the role of iASPP in the proliferation , apoptosis , invasion and metastasis of gastric cancer cells .
Methods 1 . The expression of iASPP was detected by RT - PCR and Western Blot . The expression of iASPP was detected by RT - PCR and Western Blot .
Flow cytometry was used to detect the change of cell apoptosis before and after the expression of iASPP .
The expression of KLF4 and iASPP was examined by Western Blot . The expression of KLF4 and iASPP was detected by Western Blot . The expression of iASPP in gastric cancer cells was significantly higher than that of normal gastric carcinoma ( P0.05 ) . The results of Western Blot showed that the expression of iASPP significantly inhibited the proliferation and invasion ability of MKN45 and MKN45 cells ( P0.05 ) . The results of Western Blot showed that the expression of KLF4 in MKN45 and MKN45 cells was significantly lower than that of normal gastric mucosa cells ( P0.05 ) . In gastric cancer cells , the expression level of iASPP was decreased , and the expression level of iASPP was decreased .

【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2

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本文編號：1759736