本文選題：X射線晶體學(xué) + 腫瘤　； 參考：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：抑癌基因的失活和原癌基因的異常激活會(huì)導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生,而p53是研究最為廣泛的抑癌基因,它在抑制腫瘤方面發(fā)揮著重要作用。p53作為轉(zhuǎn)錄因子能夠激活下游眾多具有不同生物學(xué)功能的靶基因的轉(zhuǎn)錄,因而具有廣泛的生物學(xué)功能,包括促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯、DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡等。在正常情況下,p53處于被抑制狀態(tài),這是由于E3泛素連接酶小鼠雙微體2(Murine double minute2, MDM2)能夠抑制其轉(zhuǎn)錄活性并介導(dǎo)其發(fā)生泛素化降解。而同時(shí)MDM2又是p53蛋白調(diào)控的靶基因,因此兩者可以形成MDM2-p53負(fù)反饋環(huán)路。細(xì)胞在應(yīng)答不同的脅迫刺激時(shí),會(huì)有不同的信號(hào)因子調(diào)控這個(gè)負(fù)反饋環(huán)路。DNA損傷會(huì)激活A(yù)TM (Ataxia telangiectasia mutated)/ATR (ATM Rad3related kinase)等激酶從而介導(dǎo)DDR (DNA damage response)信號(hào)通路；病毒侵染或癌基因過量表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)腫瘤抑制因子ARF (Alternating reading frame)表達(dá),進(jìn)而介導(dǎo)ARF-MDM2-p53信號(hào)通路；核糖體合成受阻引起“核糖體脅迫”能夠通過核糖體蛋白(Ribosomal proteins, RPs)介導(dǎo)RPs-MDM2-p53信號(hào)通路,細(xì)胞主要通過以上三條信號(hào)通路激活p53。研究發(fā)現(xiàn)在RPs-MDM2-P53信號(hào)通路中,RPL1l是激活p53最為重要的核糖體蛋白。但是,RPL1l如何抑制MDM2的E3泛素連接酶活性以實(shí)現(xiàn)激活p53的分子機(jī)制尚不清楚。 本論文經(jīng)過篩選大量不同的蛋白片段,通過原核表達(dá)并純化獲得人源MDM2290-437-RPL111-178蛋白復(fù)合物,采用坐滴蒸氣擴(kuò)散法獲得MDM2-RPL11復(fù)合物晶體,通過分子置換法解析了其三維空間結(jié)構(gòu)。在MDM2-RPL11復(fù)合物結(jié)構(gòu)中,MDM2的結(jié)構(gòu)由一個(gè)31α螺旋和2對(duì)反向平行的p折疊以及連接它們的loop組成；RPL11的結(jié)構(gòu)由6個(gè)α螺旋和7個(gè)β折疊以及連接它們的loop組成。RPL11的整體結(jié)構(gòu)類似于彎曲的“手”,MDM2緊緊地結(jié)合在RPL11形成的凹槽結(jié)構(gòu)內(nèi)。MDM2和RPL11之間存在極廣泛的接觸面,并且形成多種相互作用力,包括靜電作用、氫鍵、疏水作用和π-π堆積作用力。結(jié)構(gòu)分析顯示在MDM2-RPL11復(fù)合物中存在兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu),一個(gè)是存在于MDM2蛋白分子內(nèi)的C4型鋅指結(jié)構(gòu),另一個(gè)是分子間鋅指結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)證明這兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)對(duì)于MDM2和RPL1l的結(jié)合都發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外,結(jié)構(gòu)分析和定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證明MDM2的酸性結(jié)構(gòu)域?qū)τ贛DM2-RPL11互作也很重要,同時(shí)體外的pull-down實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)確定了MDM2-RPL11發(fā)生結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn),并且證實(shí)這些關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸殘基發(fā)生突變會(huì)破壞MDM2-RPL11的結(jié)合,最終致使p53無法被激活�；诮Y(jié)構(gòu)分析的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)闡明了癌癥患者體內(nèi)RPL1l和MDM2中關(guān)鍵性結(jié)合位點(diǎn)的突變是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的原因所在。另外,由于RPL11是核糖體60S大亞基的重要組成成分,其在核糖體內(nèi)與28SrRNA結(jié)合,將MDM2-RPL11和60S RPLll-28SrRNA復(fù)合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì),結(jié)果顯示MDM2模擬28S rRNA與RPL11相結(jié)合,并且凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)和微量熱涌動(dòng)實(shí)驗(yàn)也表明MDM2能夠與核酸競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合RPL11。在MDM2-RPL11形成復(fù)合物后,RPL11和MDM2均發(fā)生構(gòu)象變化,使得兩者結(jié)合更加緊密。MDMX (Murine double minute X)是MDM2的同源蛋白,兩者具有高度保守的功能結(jié)構(gòu)域,序列比對(duì)、結(jié)構(gòu)分析和定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)均表明MDM2中C4鋅指結(jié)構(gòu)域決定了RPL11選擇性地結(jié)合MDM2并不結(jié)合MDMX。 本論文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在一定程度上揭示了RPL11如何抑制MDM2的E3泛素連接酶活性進(jìn)而激活p53的分子機(jī)制,從而為新型抗癌藥物分子的設(shè)計(jì)提供結(jié)構(gòu)依據(jù)。
[Abstract]:p53 , as a transcription factor , can activate transcription of many target genes with different biological functions .
The expression of tumor suppressor factor ARF ( ARF ) can be induced by viral infection or overexpression of oncogene .
It is found that RPL11 is the most important ribosomal protein in the activation of p53 . However , it is not clear how to inhibit the activity of E3 ubiquitin ligase to activate p53 .

In this paper , a large number of different protein fragments were screened , and the human MDM2290 - 437 - RPL111 - 178 protein complexes were obtained by prokaryotic expression and purification .
The structure of RPL11 is similar to that of RPL11 . The structure analysis shows that there are two zinc finger structures in RPL11 .

The experimental results of this paper show some extent how RPL11 can inhibit the activity of E3 ubiquitin ligase and activate the molecular mechanism of p53 , thus providing structural basis for the design of novel anti - cancer drug molecules .

【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R73-3

【共引文獻(xiàn)】

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3 田志環(huán);焦傳珍;;蚤狀n，

本文編號(hào)：1756896