本文選題：胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞 + 分離純化��； 參考：《蘇州大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：目的:1.探討胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞分離純化、表型分析和生物學(xué)功能特性;2.探討microRNA靶向調(diào)控胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞生長(zhǎng)增殖作用;3.探討Hedgehog信號(hào)通路參與胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞生長(zhǎng)增殖調(diào)控機(jī)制。方法:1.選取手術(shù)后新鮮胰腺癌組織標(biāo)本,提取和制備原代胰腺癌細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)。腫瘤干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)分離胰腺癌細(xì)胞中干細(xì)胞樣細(xì)胞,并培養(yǎng)傳代,采用HE染色、細(xì)胞免疫熒光鑒定。應(yīng)用原代胰腺癌細(xì)胞制備裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型用以富集腫瘤細(xì)胞。RealtimeRT-PCR檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞干細(xì)胞關(guān)鍵因子的表達(dá)。構(gòu)建質(zhì)粒載體使篩選的關(guān)鍵因子啟動(dòng)子融合熒光蛋白轉(zhuǎn)染原代胰腺癌細(xì)胞并再次建立裸鼠皮下移植瘤模型。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析目標(biāo)因子陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞含量及所占比例并進(jìn)行分選。通過(guò)MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率,克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞克隆形成效率來(lái)對(duì)比干細(xì)胞關(guān)鍵因子陽(yáng)性和陰性表達(dá)細(xì)胞增殖情況,對(duì)比兩種細(xì)胞的成球能力,并進(jìn)行兩種細(xì)胞裸鼠皮下移植成瘤率的對(duì)比。2.通過(guò)miRNA芯片分別檢測(cè)干細(xì)胞關(guān)鍵因子陽(yáng)性和陰性表達(dá)細(xì)胞中的mi-RNA變化并對(duì)比分析,篩選潛在與干細(xì)胞關(guān)鍵因子表達(dá)相關(guān)的miRNA,RealtimeRT-PCR分別檢測(cè)胰腺癌組織標(biāo)本和細(xì)胞株中的相關(guān)miRNA表達(dá),通過(guò)擴(kuò)增目的基因片段,及預(yù)測(cè)作用位點(diǎn)突變類型,分別構(gòu)建入p GL4這個(gè)含有熒光素酶(Luciferase)的質(zhì)粒形成載體,和miRNA共轉(zhuǎn)染于人正常胰腺上皮細(xì)胞株HPDE6c7中,熒光素酶活性雙報(bào)告基因檢測(cè)方法明確所篩選的miRNA與相關(guān)目的干細(xì)胞因子的關(guān)系,尋找所篩選miRNA干擾胰腺癌生長(zhǎng)的潛在靶基因。構(gòu)建慢病毒載體重組轉(zhuǎn)染所篩選的miRNA至目標(biāo)基因陽(yáng)性表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞,從而上調(diào)所篩選的miRNA,通過(guò)RealtimeRT-PCR檢測(cè)所篩選miRNA重組轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞后其目標(biāo)基因的變化,western blot檢測(cè)所篩選 miRNA重組轉(zhuǎn)染目標(biāo)基因陽(yáng)性細(xì)胞后其目標(biāo)蛋白的變化。通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞克隆形成效率,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率,觀察裸鼠成瘤率變化來(lái)判斷所篩選miRNA干擾靶基因后胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)情況。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組轉(zhuǎn)染目標(biāo)基因陽(yáng)性細(xì)胞組與對(duì)照組細(xì)胞的遷移和侵襲能力變化,免疫熒光和western blot檢測(cè)重組轉(zhuǎn)染目標(biāo)基因陽(yáng)性細(xì)胞組與對(duì)照組細(xì)胞腫瘤轉(zhuǎn)移和EMT(上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化)標(biāo)志物的變化。3.MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定重組SHH-N及SHH信號(hào)通道抑制劑cyclopamine對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)率的影響,RealtimeRT-PCR反應(yīng)檢測(cè)經(jīng)重組SHH-N及cyclopamine處理后的胰腺癌細(xì)胞中SHH信號(hào)通道相關(guān)因子和干細(xì)胞關(guān)鍵因子mRNA以及相關(guān)miRNA的表達(dá)結(jié)果,western blot法測(cè)定重組SHH-N及cyclopamine對(duì)胰腺癌細(xì)胞中MMPs及PI3K/Akt的影響。結(jié)果:1.消化人原發(fā)性胰腺癌組織樣本,經(jīng)處理后由小組織塊爬出獲得胰腺癌原代細(xì)胞,培養(yǎng)5至6天后倒置顯微鏡、相差顯微鏡中均可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)融合成單層貼壁細(xì)胞,融合度超過(guò)85%,細(xì)胞透明、細(xì)胞間緊密連接,具有連片能力。采用HE染色觀察胰腺癌原代細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征,可見(jiàn)原代胰腺癌細(xì)胞90%以上細(xì)胞融合貼壁,放大后細(xì)胞呈多邊形,胞漿較寬,形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)獲得胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞具有自我增殖和多向分化的功能。細(xì)胞免疫熒光提示與其它干細(xì)胞關(guān)鍵因子C-myc、CD133相比Oct-4陽(yáng)性表達(dá)最高。RealtimeRT-PCR檢測(cè)顯示胰腺癌細(xì)胞原代細(xì)胞和裸鼠移植瘤組織標(biāo)本中,Oct-4、C-myc、CD133作為常用干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞關(guān)鍵因子均呈陽(yáng)性表達(dá)。其中相對(duì)于原代細(xì)胞,Oct-4在裸鼠移植瘤標(biāo)本中陽(yáng)性表達(dá)率較高。因此我們篩選了Oct-4作為胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的特異性標(biāo)志物,通過(guò)構(gòu)建質(zhì)粒載體使Oct-4啟動(dòng)子融合YFP熒光蛋白,轉(zhuǎn)染原代胰腺癌細(xì)胞并培養(yǎng)后再次建立裸鼠皮下移植瘤模型以富集腫瘤細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示Oct-4陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞在原代胰腺癌細(xì)胞占2.79%,在裸鼠原代腫瘤皮下移植瘤模型腫瘤細(xì)胞中占7.84%,顯著升高,P0.05,其存活率、成瘤率、克隆形成以及腫瘤細(xì)胞成球能力均大于Oct-4陰性細(xì)胞,P0.05。Oct-4陽(yáng)性細(xì)胞成瘤能力大于陰性細(xì)胞。2.miRNA芯片檢測(cè)顯示Oct-4陽(yáng)性細(xì)胞中miR-335表達(dá)量明顯低于Oct-4陰性細(xì)胞。18組胰腺癌組織標(biāo)本和細(xì)胞株中mi-335表達(dá)量也明顯低于正常組織或細(xì)胞。Target-Scan顯示Oct-4基因中可能存在mi-335干擾靶點(diǎn)。內(nèi)源性mi-335增強(qiáng)劑與p GL4-OCT4-WT共轉(zhuǎn)染細(xì)胞組中的熒光素酶活性比對(duì)照細(xì)胞組下降明顯。與對(duì)照組相比,miR-335重組轉(zhuǎn)染Oct-4陽(yáng)性細(xì)胞組的Oct-4 mRNA和蛋白表達(dá)水平均下調(diào),與對(duì)照組相比,miR-335重組轉(zhuǎn)染胰腺癌Oct-4陰性細(xì)胞組中克隆形成能力下降明顯,凋亡率明顯上升,成瘤率明顯下降,腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯下降。與對(duì)照組相比,miR-335重組轉(zhuǎn)染Oct-4陽(yáng)性細(xì)胞組中,間充質(zhì)標(biāo)志物Fibronectin,Vimentin,α-SMA,和SNAIL1下調(diào),上皮標(biāo)志物E-cadherin上調(diào)。3.重組SHH-N可增加胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的生長(zhǎng)率以及克隆形成能力,SHH信號(hào)通路抑制劑cyclopamine則抑制其生長(zhǎng)率以及克隆形成能力。相對(duì)于對(duì)照組以及Oct-4陰性細(xì)胞組,經(jīng)重組SHH-N處理后SHH通路各信號(hào)因子以及Oct-4在Oct-4陽(yáng)性細(xì)胞中表達(dá)明顯提高,而miR-335表達(dá)明顯下降;經(jīng)cyclopamine處理后SHH通路各信號(hào)因子僅有Smo表達(dá)在Oct-4陽(yáng)性細(xì)胞中明顯下降,其余信號(hào)因子表達(dá)下降不明顯,Oct-4表達(dá)也有明顯下降,而miR-335表達(dá)明顯提高。重組SHH-N孵育24h可增加胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá),而cyclopamine可抑制MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá);重組SHH-N孵育24h可增加胰腺癌細(xì)胞中Akt蛋白磷酸化的表達(dá),cyclopamine則呈劑量依賴性減少胰腺癌細(xì)胞中Akt蛋白的磷酸化�？梢�(jiàn)SHH信號(hào)通路對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路具有調(diào)控作用,激活SHH信號(hào)通路可上調(diào)胰腺癌細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)增加Akt磷酸化,同時(shí)下調(diào)miR-335表達(dá),促進(jìn)Oct-4表達(dá),從而影響了胰腺癌細(xì)胞干性特征,促進(jìn)了腫瘤生長(zhǎng)增殖。結(jié)論:1.通過(guò)分離培養(yǎng)胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞,并建立裸鼠皮下移植瘤模型富集腫瘤特別是腫瘤干細(xì)胞,RealtimeRT-PCR及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)鑒定標(biāo)志物表達(dá),篩選了胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Oct-4作為胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的特異性標(biāo)志物,FCM分析陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞含量及所占比例并進(jìn)行分選純化。通過(guò)測(cè)定細(xì)胞存活率、克隆形成效率以及裸鼠皮下移植成瘤率對(duì)比明確了Oct-4陽(yáng)性細(xì)胞具有胰腺癌干細(xì)胞類細(xì)胞的生物學(xué)特性。2.miR-335表達(dá)量在Oct-4(+)細(xì)胞中明顯低于Oct-4(-)細(xì)胞。胰腺癌組織標(biāo)本和細(xì)胞株中mi-335表達(dá)量也明顯低于正常組織或細(xì)胞。通過(guò)重組轉(zhuǎn)染細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-335,可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中Oct-4表達(dá)量明顯下降,同時(shí)抑制了其增殖以及轉(zhuǎn)移侵襲能力。從而明確了胰腺癌中miR-335可以通過(guò)靶基因Oct-4抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展以及其干細(xì)胞樣的特性改變,這可以作為一個(gè)潛在新的治療胰腺癌方向。3.SHH信號(hào)通路通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)的上調(diào)MMP-2、MMP-9表達(dá)和增加Akt磷酸化,同時(shí)下調(diào)miR-335進(jìn)而影響Oct-4陽(yáng)性表達(dá),這一過(guò)程是對(duì)胰腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞生長(zhǎng)增殖進(jìn)行調(diào)控的重要機(jī)制。
[Abstract]:Objective : 1 . To investigate the effect of miRNA on the growth and proliferation of pancreatic cancer cell - like cells . Compared with the control group , the expression of Oct - 4 , C - myc and CD133 of Oct - 4 positive cells was significantly lower than that in control group . Conclusion : 1 . The expression of miR - 335 in pancreatic cancer tissue is significantly lower than that in Oct - 4 ( - ) cells . The expression of Oct - 4 in pancreatic cancer tissue is significantly lower than that in Oct - 4 ( - ) cells .

【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.9

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本文編號(hào)：1748707