本文選題：胰腺癌干細胞樣細胞 + 分離純化��； 參考：《蘇州大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：目的:1.探討胰腺癌干細胞樣細胞分離純化、表型分析和生物學(xué)功能特性;2.探討microRNA靶向調(diào)控胰腺癌干細胞樣細胞生長增殖作用;3.探討Hedgehog信號通路參與胰腺癌干細胞樣細胞生長增殖調(diào)控機制。方法:1.選取手術(shù)后新鮮胰腺癌組織標本,提取和制備原代胰腺癌細胞,進行細胞體外擴增培養(yǎng)。腫瘤干細胞成球?qū)嶒灧蛛x胰腺癌細胞中干細胞樣細胞,并培養(yǎng)傳代,采用HE染色、細胞免疫熒光鑒定。應(yīng)用原代胰腺癌細胞制備裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型用以富集腫瘤細胞。RealtimeRT-PCR檢測胰腺癌細胞干細胞關(guān)鍵因子的表達。構(gòu)建質(zhì)粒載體使篩選的關(guān)鍵因子啟動子融合熒光蛋白轉(zhuǎn)染原代胰腺癌細胞并再次建立裸鼠皮下移植瘤模型。流式細胞術(shù)(FCM)分析目標因子陽性表達細胞含量及所占比例并進行分選。通過MTT法測定細胞存活率,克隆形成實驗測定細胞克隆形成效率來對比干細胞關(guān)鍵因子陽性和陰性表達細胞增殖情況,對比兩種細胞的成球能力,并進行兩種細胞裸鼠皮下移植成瘤率的對比。2.通過miRNA芯片分別檢測干細胞關(guān)鍵因子陽性和陰性表達細胞中的mi-RNA變化并對比分析,篩選潛在與干細胞關(guān)鍵因子表達相關(guān)的miRNA,RealtimeRT-PCR分別檢測胰腺癌組織標本和細胞株中的相關(guān)miRNA表達,通過擴增目的基因片段,及預(yù)測作用位點突變類型,分別構(gòu)建入p GL4這個含有熒光素酶(Luciferase)的質(zhì)粒形成載體,和miRNA共轉(zhuǎn)染于人正常胰腺上皮細胞株HPDE6c7中,熒光素酶活性雙報告基因檢測方法明確所篩選的miRNA與相關(guān)目的干細胞因子的關(guān)系,尋找所篩選miRNA干擾胰腺癌生長的潛在靶基因。構(gòu)建慢病毒載體重組轉(zhuǎn)染所篩選的miRNA至目標基因陽性表達的胰腺癌細胞,從而上調(diào)所篩選的miRNA,通過RealtimeRT-PCR檢測所篩選miRNA重組轉(zhuǎn)染陽性細胞后其目標基因的變化,western blot檢測所篩選 miRNA重組轉(zhuǎn)染目標基因陽性細胞后其目標蛋白的變化。通過克隆形成實驗測定細胞克隆形成效率,流式細胞儀分析細胞凋亡率,觀察裸鼠成瘤率變化來判斷所篩選miRNA干擾靶基因后胰腺癌細胞生長情況。Transwell侵襲實驗檢測重組轉(zhuǎn)染目標基因陽性細胞組與對照組細胞的遷移和侵襲能力變化,免疫熒光和western blot檢測重組轉(zhuǎn)染目標基因陽性細胞組與對照組細胞腫瘤轉(zhuǎn)移和EMT(上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化)標志物的變化。3.MTT法和克隆形成實驗測定重組SHH-N及SHH信號通道抑制劑cyclopamine對胰腺癌細胞生長率的影響,RealtimeRT-PCR反應(yīng)檢測經(jīng)重組SHH-N及cyclopamine處理后的胰腺癌細胞中SHH信號通道相關(guān)因子和干細胞關(guān)鍵因子mRNA以及相關(guān)miRNA的表達結(jié)果,western blot法測定重組SHH-N及cyclopamine對胰腺癌細胞中MMPs及PI3K/Akt的影響。結(jié)果:1.消化人原發(fā)性胰腺癌組織樣本,經(jīng)處理后由小組織塊爬出獲得胰腺癌原代細胞,培養(yǎng)5至6天后倒置顯微鏡、相差顯微鏡中均可見細胞生長融合成單層貼壁細胞,融合度超過85%,細胞透明、細胞間緊密連接,具有連片能力。采用HE染色觀察胰腺癌原代細胞的形態(tài)學(xué)特征,可見原代胰腺癌細胞90%以上細胞融合貼壁,放大后細胞呈多邊形,胞漿較寬,形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果表明實驗獲得胰腺癌干細胞樣細胞具有自我增殖和多向分化的功能。細胞免疫熒光提示與其它干細胞關(guān)鍵因子C-myc、CD133相比Oct-4陽性表達最高。RealtimeRT-PCR檢測顯示胰腺癌細胞原代細胞和裸鼠移植瘤組織標本中,Oct-4、C-myc、CD133作為常用干細胞和腫瘤干細胞關(guān)鍵因子均呈陽性表達。其中相對于原代細胞,Oct-4在裸鼠移植瘤標本中陽性表達率較高。因此我們篩選了Oct-4作為胰腺癌干細胞樣細胞的特異性標志物,通過構(gòu)建質(zhì)粒載體使Oct-4啟動子融合YFP熒光蛋白,轉(zhuǎn)染原代胰腺癌細胞并培養(yǎng)后再次建立裸鼠皮下移植瘤模型以富集腫瘤細胞。流式細胞儀分析結(jié)果顯示Oct-4陽性表達細胞在原代胰腺癌細胞占2.79%,在裸鼠原代腫瘤皮下移植瘤模型腫瘤細胞中占7.84%,顯著升高,P0.05,其存活率、成瘤率、克隆形成以及腫瘤細胞成球能力均大于Oct-4陰性細胞,P0.05。Oct-4陽性細胞成瘤能力大于陰性細胞。2.miRNA芯片檢測顯示Oct-4陽性細胞中miR-335表達量明顯低于Oct-4陰性細胞。18組胰腺癌組織標本和細胞株中mi-335表達量也明顯低于正常組織或細胞。Target-Scan顯示Oct-4基因中可能存在mi-335干擾靶點。內(nèi)源性mi-335增強劑與p GL4-OCT4-WT共轉(zhuǎn)染細胞組中的熒光素酶活性比對照細胞組下降明顯。與對照組相比,miR-335重組轉(zhuǎn)染Oct-4陽性細胞組的Oct-4 mRNA和蛋白表達水平均下調(diào),與對照組相比,miR-335重組轉(zhuǎn)染胰腺癌Oct-4陰性細胞組中克隆形成能力下降明顯,凋亡率明顯上升,成瘤率明顯下降,腫瘤細胞遷移和侵襲能力明顯下降。與對照組相比,miR-335重組轉(zhuǎn)染Oct-4陽性細胞組中,間充質(zhì)標志物Fibronectin,Vimentin,α-SMA,和SNAIL1下調(diào),上皮標志物E-cadherin上調(diào)。3.重組SHH-N可增加胰腺癌干細胞樣細胞的生長率以及克隆形成能力,SHH信號通路抑制劑cyclopamine則抑制其生長率以及克隆形成能力。相對于對照組以及Oct-4陰性細胞組,經(jīng)重組SHH-N處理后SHH通路各信號因子以及Oct-4在Oct-4陽性細胞中表達明顯提高,而miR-335表達明顯下降;經(jīng)cyclopamine處理后SHH通路各信號因子僅有Smo表達在Oct-4陽性細胞中明顯下降,其余信號因子表達下降不明顯,Oct-4表達也有明顯下降,而miR-335表達明顯提高。重組SHH-N孵育24h可增加胰腺癌干細胞樣細胞中MMP-2、MMP-9蛋白的表達,而cyclopamine可抑制MMP-2、MMP-9蛋白的表達;重組SHH-N孵育24h可增加胰腺癌細胞中Akt蛋白磷酸化的表達,cyclopamine則呈劑量依賴性減少胰腺癌細胞中Akt蛋白的磷酸化�？梢奡HH信號通路對PI3K/Akt信號通路具有調(diào)控作用,激活SHH信號通路可上調(diào)胰腺癌細胞MMP-2、MMP-9蛋白表達增加Akt磷酸化,同時下調(diào)miR-335表達,促進Oct-4表達,從而影響了胰腺癌細胞干性特征,促進了腫瘤生長增殖。結(jié)論:1.通過分離培養(yǎng)胰腺癌干細胞樣細胞,并建立裸鼠皮下移植瘤模型富集腫瘤特別是腫瘤干細胞,RealtimeRT-PCR及免疫熒光細胞化學(xué)檢測鑒定標志物表達,篩選了胚胎干細胞轉(zhuǎn)錄因子Oct-4作為胰腺癌干細胞樣細胞的特異性標志物,FCM分析陽性表達細胞含量及所占比例并進行分選純化。通過測定細胞存活率、克隆形成效率以及裸鼠皮下移植成瘤率對比明確了Oct-4陽性細胞具有胰腺癌干細胞類細胞的生物學(xué)特性。2.miR-335表達量在Oct-4(+)細胞中明顯低于Oct-4(-)細胞。胰腺癌組織標本和細胞株中mi-335表達量也明顯低于正常組織或細胞。通過重組轉(zhuǎn)染細胞過表達miR-335,可導(dǎo)致腫瘤細胞中Oct-4表達量明顯下降,同時抑制了其增殖以及轉(zhuǎn)移侵襲能力。從而明確了胰腺癌中miR-335可以通過靶基因Oct-4抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展以及其干細胞樣的特性改變,這可以作為一個潛在新的治療胰腺癌方向。3.SHH信號通路通過PI3K/Akt信號通路介導(dǎo)的上調(diào)MMP-2、MMP-9表達和增加Akt磷酸化,同時下調(diào)miR-335進而影響Oct-4陽性表達,這一過程是對胰腺癌干細胞樣細胞生長增殖進行調(diào)控的重要機制。
[Abstract]:Objective : 1 . To investigate the effect of miRNA on the growth and proliferation of pancreatic cancer cell - like cells . Compared with the control group , the expression of Oct - 4 , C - myc and CD133 of Oct - 4 positive cells was significantly lower than that in control group . Conclusion : 1 . The expression of miR - 335 in pancreatic cancer tissue is significantly lower than that in Oct - 4 ( - ) cells . The expression of Oct - 4 in pancreatic cancer tissue is significantly lower than that in Oct - 4 ( - ) cells .

【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.9

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本文編號：1748707