本文選題：腫瘤干細(xì)胞　切入點(diǎn)：miRNAs　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：研究背景目前,肺癌是死亡率居于首位的腫瘤疾病,肺腺癌是最主要的亞型,約占肺癌的40%。肺腺癌早期無(wú)癥狀或局部癥狀較少,發(fā)展進(jìn)程相對(duì)較長(zhǎng),晚期通常易復(fù)發(fā)。過(guò)去十年,雖然針對(duì)EGFR和ALK的治療取得相應(yīng)的進(jìn)展,但是由于化療抵抗,復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍然是面臨的挑戰(zhàn),晚期患者五年15%的存活率并沒(méi)有明顯改善。有學(xué)者提出,在惡性腫瘤組織中存在著一小部分具有干細(xì)胞樣特性的細(xì)胞亞群,也就是被普遍稱為的腫瘤干樣細(xì)胞(cancer stem-like cells,CSLCs)或稱腫瘤起始細(xì)胞(tumor initiating cells,TICs),不僅具有與干細(xì)胞相類似的自我更新和多項(xiàng)分化的能力,而且被認(rèn)為可能是多種類型腫瘤的起源。研究表明,在肺癌及肺腺癌中也存在有腫瘤干細(xì)胞,被稱為肺癌干細(xì)胞(lung cancer stem cells,LCSCs),其對(duì)化療藥物,放射治療具有抵抗能力,因此提出肺癌干細(xì)胞是肺癌復(fù)發(fā),轉(zhuǎn)移的根本。換言之,肺癌也是一種干細(xì)胞疾病,因此,從肺腺癌干細(xì)胞這一角度作為切入點(diǎn)進(jìn)一步研究將為治療肺腺癌開拓新理念。腫瘤干細(xì)胞除了比普通腫瘤細(xì)胞在侵襲轉(zhuǎn)移能力上更強(qiáng),以及對(duì)放化療抵抗能力之外,其本質(zhì)的區(qū)別是具有干細(xì)胞特性,也即自我更新(self-renewal)。無(wú)論是腫瘤的起始進(jìn)展還是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移灶的形成均有賴于腫瘤干細(xì)胞的自我更新。因此,闡明腫瘤干細(xì)胞的自我更新機(jī)制有助于研制出改善肺癌生存率的有效藥物。腫瘤干細(xì)胞的自我更新不僅受到內(nèi)在信號(hào)的調(diào)控,比如Notch,Hedgehog,EGF,FGF,IGF等信號(hào)通路,同時(shí)也受到mi RNAs的調(diào)控,mi RNAs(microRNAs)是一類近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)約19-22個(gè)核苷酸(nt)的非編碼單鏈小分子RNA,主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因(target)蛋白的表達(dá)。眾多的證據(jù)表明,mi RNA參與腫瘤的調(diào)控作用不容忽視。類似于癌基因或抑癌基因在腫瘤細(xì)胞的一系列的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。mi RNA的序列雖小,但是僅一個(gè)mi RNA就可以調(diào)控多個(gè)靶基因,形成序列放大的基因調(diào)控通路;而一個(gè)miRNA也可以受多個(gè)基因的調(diào)控,從而在生物體內(nèi)構(gòu)成了一個(gè)龐大的復(fù)雜基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。目前研究發(fā)現(xiàn),miRNA參與了干細(xì)胞以及腫瘤干細(xì)胞自我更新和多向分化潛能的調(diào)節(jié),是mirna領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),方興未艾。例如mir-290、mir-296通過(guò)靶向自我更新相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子oct-4、tcf3、sox2、nanog調(diào)控胚胎干細(xì)胞的自我更新和多向分化。let-7通過(guò)h-ras和hmga2調(diào)控乳腺癌干細(xì)胞的自我更新及惡性增殖等。那么,肺癌干細(xì)胞的自我更新是如何被調(diào)控的呢?是否有mirnas調(diào)控了肺癌干細(xì)胞的自我更新呢?它們是怎樣參與肺癌干細(xì)胞自我更新的呢?對(duì)指導(dǎo)臨床工作又有怎樣的意義呢?這些問(wèn)題成為本課題研究的主要內(nèi)容。研究目的1.檢測(cè)肺腺癌干細(xì)胞中mir-214的表達(dá)。2.明確mir-214在肺腺癌干細(xì)胞自我更新中的調(diào)控作用。3.探討mir-214調(diào)控肺腺癌干細(xì)胞自我更新的具體機(jī)制。研究方法一、mir-214在肺腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)1.通過(guò)過(guò)表達(dá)mir-214,采用real-timepcr方法,比較a549,nci-h1650肺癌細(xì)胞系來(lái)源的cslcs和非cslcs中干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。2.通過(guò)過(guò)表達(dá)mir-214,采用成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)a549,nci-h1650肺癌細(xì)胞系“球狀”生長(zhǎng)能力,流式細(xì)胞技術(shù)驗(yàn)證cd133+/epcam+比例。3.采用real-timepcr檢測(cè)a549,nci-h1650肺癌細(xì)胞系來(lái)源的cslcs和非cslcs中mir-214的表達(dá);通過(guò)a549,nci-h1650來(lái)源的cslcs再分化實(shí)驗(yàn),檢測(cè)分化過(guò)程中mir-214的表達(dá)情況。二、mir-214在laccslcs自我更新中的作用1.通過(guò)構(gòu)建sh-mir-214慢病毒,采用成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)mir-214體外對(duì)a549,nci-h1650肺癌細(xì)胞系來(lái)源的cslcs和原代肺癌細(xì)胞來(lái)源的cslcs自我更新的作用。2.通過(guò)構(gòu)建sh-mir-214慢病毒,采用real-timepcr,免疫熒光技術(shù),western-blot檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)記物(nanog,oct-4,sox-2,epcam)的表達(dá)。3.通過(guò)構(gòu)建sh-mir-214慢病毒,采用pcrarray檢測(cè)mir-214對(duì)自我更新相關(guān)信號(hào)通路的影響。4.通過(guò)構(gòu)建sh-mir-214慢病毒后裸鼠體內(nèi)荷瘤實(shí)驗(yàn)研究mir-214對(duì)nci-h1650肺癌細(xì)胞系來(lái)源的cslcs體內(nèi)成瘤能力的影響。三、mir-214調(diào)控laccslcs自我更新作用的機(jī)制1.通過(guò)生物信息學(xué)方法和自我更新相關(guān)基因篩選mir-214的靶基因,并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因,real-timepcr,western-blot和免疫熒光等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。2.通過(guò)雙轉(zhuǎn)染sh-mir-214sh-ctnnbip1,采用成球?qū)嶒?yàn),real-timepcr,,western-blot和免疫熒光染色技術(shù)驗(yàn)證mir-214通過(guò)靶基因ctnnbip1在laccslcs自我更新中的作用。3.通過(guò)免疫組織化學(xué)等方法研究ctnnbip1在iiia期肺腺癌患者中的臨床意義。研究結(jié)果1.mir-214在laccslcs中高表達(dá)我們通過(guò)mir-214過(guò)表達(dá)慢病毒載體技術(shù),檢測(cè)了mir-214對(duì)a549,nci-h1650肺癌細(xì)胞成球能力的作用,驗(yàn)證了干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá);比較了a549,nci-h1650肺癌細(xì)胞系及原代肺癌來(lái)源的laccslcs和非cslcs之間mir-214的表達(dá)差異,通過(guò)成球?qū)嶒?yàn)和real-timepcr結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)mir-214后,肺癌細(xì)胞a549,nci-h1650表現(xiàn)出成“球狀”生長(zhǎng),其干細(xì)胞比例及標(biāo)志物表達(dá)明顯高于對(duì)照組;通過(guò)real-timepcr結(jié)果顯示:a549,nci-h1650及原代肺癌來(lái)源的cslcsmir-214表達(dá)高于非cslcs;再分化過(guò)程中mir-214表達(dá)呈下降趨勢(shì)。提示mir-214在laccslcs自我更新中發(fā)揮重要作用,因此,我們選擇對(duì)mir-214參與laccslcs自我更新進(jìn)行深入研究。2.mir-214促進(jìn)laccslcs自我更新為了進(jìn)一步明確mir-214在laccslcs中的作用,我們通過(guò)構(gòu)建sh-mir-214慢病毒轉(zhuǎn)染建立穩(wěn)定表達(dá)的laccslcs,通過(guò)衡量sh-mir-214轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組成球數(shù)量和成球大小,證明mir-214促進(jìn)laccslcs的自我更新。通過(guò)real-timepcr證實(shí)了下調(diào)mir-214表達(dá)后,與對(duì)照組相比,a549,nci-h1650來(lái)源的cslcs干細(xì)胞標(biāo)記物(nanog、oct-4、epcam)mrna表達(dá)水平明顯降低。通過(guò)western-blot,免疫熒光技術(shù)進(jìn)一步證明sh-mir-214轉(zhuǎn)染組nanog、sox-2、oct-4的蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組。同時(shí),pcrarray結(jié)果顯示:下調(diào)mir-214表達(dá)的laccslcs自我更新相關(guān)信號(hào)通路受到顯著的影響。以上結(jié)果表明,mir-214能夠促進(jìn)肺腺癌干細(xì)胞自我更新。此外,通過(guò)體內(nèi)荷瘤實(shí)驗(yàn)證明mir-214在體內(nèi)成瘤方面具有更強(qiáng)的致瘤作用。3.mir-214通過(guò)靶基因ctnnbip1調(diào)控laccslcs自我更新通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)mir-214的潛在靶基因,結(jié)合pcrarray結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)mir-214后影響最為顯著的自我更新相關(guān)通路為wnt,在此基礎(chǔ)上篩選出ctnnbip1為潛在靶基因,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)了ctnnbip1是mir-214的直接靶基因。real-timepcr結(jié)果同時(shí)表明肺癌組織中mir-214與ctnnbip1mrna的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。通過(guò)western-blot,免疫熒光進(jìn)一步驗(yàn)證了下調(diào)mir-214表達(dá)后,ctnnbip1蛋白水平表達(dá)顯著升高。提示mir-214能夠調(diào)控ctnnbip1蛋白水平的表達(dá)。為了明確miR-214是否通過(guò)靶基因CTNNBIP1參與肺癌干細(xì)胞自我更新,我們通過(guò)雙轉(zhuǎn)染sh-mi R-214sh-CTNNBIP1,檢測(cè)CSLCs的成球數(shù)量和成球大小的改變,發(fā)現(xiàn)雙轉(zhuǎn)染的CSLCs成球數(shù)量和成球大小顯著高于sh-mi R-214轉(zhuǎn)染組。通過(guò)western-blot結(jié)果表明,相較于sh-mi R-214轉(zhuǎn)染組,sh-miR-214sh-CTNNBIP1雙轉(zhuǎn)染組CTNNBIP1蛋白水平表達(dá)顯著降低,β-catenin,Cyclin D1,Oct-4,Sox-2表達(dá)水平顯著升高。以上結(jié)果表明,mi R-214是通過(guò)CTNNBIP1參與LAC CSLCs的自我更新。為了驗(yàn)證在肺腺癌中CTNNBIP1的表達(dá)是否影響患者的生存預(yù)后,我們找到IIIa期肺腺癌患者病理標(biāo)本,采用免疫組化的方法檢測(cè)CTNNBIP1在肺腺癌中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)高分化肺癌組織中CTNNBIP1表達(dá)高于低分化肺癌組織,高分化肺癌組織中Ki67表達(dá)高于低分化肺癌組織;經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CTNNBIP1的表達(dá)與肺腺癌的分化程度呈正相關(guān),且與Ki67的表達(dá)呈反相關(guān);進(jìn)一步通過(guò)Kaplan-Meier生存曲線發(fā)現(xiàn),CTNNBIP1高表達(dá)組生存時(shí)間顯著高于低表達(dá)組,提示CTNNBIP1與肺腺癌預(yù)后密切相關(guān)。研究結(jié)論在肺腺癌中,mi R-214在LAC CSLCs中高表達(dá),并通過(guò)CTNNBIP1促進(jìn)LAC CSLCs的自我更新和小鼠體內(nèi)成瘤,臨床上,CTNNBIP1的表達(dá)與生存期密切相關(guān),是肺腺癌預(yù)后的重要指標(biāo)。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 吳明富;楊潔;項(xiàng)濤;史艷燕;劉麗江;;miR-21 Targets Fas Ligand-mediated Apoptosis in Breast Cancer Cell Line MCF-7[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2014年02期

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本文編號(hào)：1729558