本文選題：CD47　切入點：非小細胞肺癌　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景和目的:肺癌在我國發(fā)病率極高,據(jù)報道近十幾年肺癌分別占在我國男性和女性惡性腫瘤發(fā)病率的第一和第二位,并且發(fā)病年齡也出現(xiàn)了下降的趨勢。其中非小細胞肺癌作為肺癌的一個大類發(fā)病率也逐年增高,近年來肺癌相關(guān)領(lǐng)域基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究及臨床診斷治療方法逐漸進步,越來越多的肺癌患者得到了規(guī)范的治療,使得肺癌的診治率有了很大的提升,然而由于肺癌表現(xiàn)出較強的侵襲性,尤其是一旦肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移,患者即將面臨極高的死亡威脅。因此,總體來說,對肺癌的轉(zhuǎn)移情況進行控制仍然是肺癌領(lǐng)域需要解決的重要關(guān)鍵問題。然而目前腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機制仍不清楚。為了探索腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機制,近年來,CD47分子逐漸引起了大家的關(guān)注。其重要原因在于,研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞可以表達 別吃我‖信號,從而使得巨噬細胞對腫瘤吞噬作用減低,出現(xiàn)腫瘤對免疫逃逸現(xiàn)象,這種現(xiàn)象與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。而腫瘤細胞高表達的CD47分子就是一種 別吃我‖信號分子。當(dāng)腫瘤細胞表面CD47分子與巨噬細胞的表面SIRPα分子組合成CD47-SIRPα信號復(fù)合體時,導(dǎo)致巨噬細胞SIRPα分子的細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)中免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)發(fā)生磷酸化,因此可以傳導(dǎo)抑制性信號通路,即 別吃我‖信號來減少巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬活性,這樣便產(chǎn)生腫瘤細胞的免疫逃逸現(xiàn)象。而且CD47高水平表達與血液系統(tǒng)惡性腫瘤和部分實體腫瘤的分化程度、轉(zhuǎn)移能力、生存率及預(yù)后密切相關(guān)。CD47與腫瘤相關(guān)性研究得到越來越多關(guān)注,然而CD47在肺癌表達及與轉(zhuǎn)移的相關(guān)性等研究未見相關(guān)報道。另一方面,除了研究者關(guān)注的CD47-SIRPα信號復(fù)合體引起的腫瘤免疫逃逸現(xiàn)象,另有研究者提出cd47與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用仍有其他機制參與其中,然而相關(guān)的機制研究甚少。因此,本研究亦將對cd47與轉(zhuǎn)移的相關(guān)作用機制進行初步的探討。我們通過組織標(biāo)本和肺癌細胞株的cd47表達情況進行分別檢測,并利用體內(nèi)和體外實驗分別對cd47與肺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性進行分析驗證。最后對cd47與肺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制進行初步探討。本研究分以下三部分進行。研究方法:1.非小細胞肺癌組織cd47的表達及其臨床意義選取20例非小細胞肺癌者切除的手術(shù)標(biāo)本,利用westernblotting方法對癌及癌旁組織中的cd47表達水平進行檢測。同時采用免疫組織化學(xué)檢測方法對80例非小細胞肺癌患者的石蠟組織切片對cd47表達水平進行檢測,通過免疫組織化學(xué)評分將80例患者按照cd47表達水平分為低表達cd47組和高表達cd47組,利用統(tǒng)計學(xué)分析的方法對不同cd47表達水平與病理分型、腫瘤分化程度及tnm分期等臨床病理特征進行分析。2.cd47在nsclc侵襲轉(zhuǎn)移中的作用本部分研究分別從體外實驗和體內(nèi)實驗兩方面進行闡述。體外實驗部分:首先利用westernblot、real-timepcr和細胞免疫熒光對不同肺癌細胞株的cd47表達情況進行檢測。為驗證cd47表達水平與細胞轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系,我們構(gòu)建了基于微流控芯片技術(shù)的轉(zhuǎn)移模型。利用該模型我們可以對細胞在不同情況下的轉(zhuǎn)移情況進行實時的動態(tài)觀察。利用rna干擾技術(shù)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)分別下調(diào)或上調(diào)肺腺癌細胞株a549和肺鱗癌細胞株nci-h520的cd47表達,將進行不同處理的各組細胞株分別注入微流控芯片轉(zhuǎn)移模型內(nèi)觀察72小時后細胞的轉(zhuǎn)移情況,分析不同cd47表達水平表現(xiàn)出的肺癌細胞體外轉(zhuǎn)移能力的差異和區(qū)別。體內(nèi)實驗部分:通過皮下注射構(gòu)建原位肺癌模型、通過尾靜脈注射構(gòu)建肺癌移植模型,同時利用shrna穩(wěn)定下調(diào)a549細胞的cd47表達,觀察在兩種動物模型中不同cd47表達的a549細胞的原位成瘤以及腫瘤轉(zhuǎn)移情況,進一步驗證cd47與肺癌發(fā)展轉(zhuǎn)移的影響。3.cd47促進非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移機制的初步探討為探討cdc42作為cd47的下游分子參與非小細胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移我們進行以下研究,利用westernblot方法檢測不同肺癌細胞株cd47和cdc42的表達情況;通過rna干擾技術(shù)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)分別下調(diào)或上調(diào)肺腺癌細胞株a549和肺鱗癌細胞株nci-h520的cd47表達,進一步觀察cd47表達水平變化是否伴隨cdc42表達改變。上調(diào)cd47表達的a549和nci-h520細胞株再利用rna干擾技術(shù)下調(diào)cdc42表達后觀察不同處理情況的細胞株在微流控芯片轉(zhuǎn)移平臺內(nèi)細胞轉(zhuǎn)移能力的情況。最后對80例非小細胞肺癌患者的石蠟切片cd47表達與cdc42表達情況進行統(tǒng)計分析。結(jié)果:1.非小細胞肺癌組織cd47的表達及其臨床意義利用westernblotting蛋白檢測方法對20例非小細胞肺癌患者的手術(shù)切除組織標(biāo)本的癌及癌旁組織中cd47表達水平進行檢測,發(fā)現(xiàn)癌組織的cd47表達水平明顯高于癌旁組織(p0.05)。同時采用免疫組織化學(xué)檢測方法對80例非小細胞肺癌患者的石蠟切片對cd47表達水平進行檢測,結(jié)果亦證實癌組織cd47表達明顯高于癌旁組織,對不同患者的cd47表達水平進行分組,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達cd47與tnm分期密切相關(guān),高表達cd47的患者更易出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移;另外高表達cd47與臨床分期亦相關(guān),高表達cd47的患者臨床分期越差。提過提示cd47表達水平與非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān),對cd47的表達檢測將對臨床轉(zhuǎn)移和預(yù)后的判斷具有重要意義。2.cd47在nsclc侵襲轉(zhuǎn)移中的作用為了在體外觀察驗證細胞的轉(zhuǎn)移能力,我們成功構(gòu)建了基于微流控芯片技術(shù)的細胞轉(zhuǎn)移模型。利用該模型我們可以實時對不同細胞的轉(zhuǎn)移情況進行動態(tài)觀察。為了更加全面驗證的cd47在nsclc侵襲轉(zhuǎn)移中的作用,我們分別選取了肺腺癌細胞株a549和肺鱗癌細胞株nci-h520分別進行檢測分析。利用rna干擾技術(shù)成功將a549和nci-h520的cd47表達水平下調(diào),進而將未處理和下調(diào)cd47表達的a549和nci-h520細胞分別注入微流控芯片轉(zhuǎn)移模型內(nèi),觀察72小時后細胞的轉(zhuǎn)移情況,結(jié)果證實在下調(diào)cd47表達的a549和nci-h520細胞轉(zhuǎn)移數(shù)量較對照組明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。為進一步驗證,我們利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染a549和nci-h520細胞穩(wěn)定上調(diào)cd47表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在上調(diào)cd47表達后a549和nci-h520的細胞轉(zhuǎn)移數(shù)量明顯增高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。體內(nèi)實驗進一步觀察,穩(wěn)定下調(diào)cd47表達的a549組6只裸鼠的皮下成瘤體積大小較a549組明顯減小;在尾靜脈注射轉(zhuǎn)移模型小鼠中同樣觀察到穩(wěn)定下調(diào)cd47表達的a549組形成的肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量少于a549組。3.cd47促進非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移機制的初步探討通過westernblot檢測了不同肺癌細胞株cd47蛋白表達與cdc42蛋白表達情況,發(fā)現(xiàn)在高表達cd47的細胞株中cdc42也呈高表達,反之亦然。為驗證cdc42作為cd47的下游分子參與了肺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,我們對a549和nci-h520分別下調(diào)或上調(diào)cd47表達,利用westernblot檢測了cdc42的蛋白表達情況,結(jié)果表明cd47表達水平的變化伴隨了cdc42表達水平的改變。對80例肺癌患者對組織切片進行免疫組織化學(xué)染色觀察,發(fā)現(xiàn)在高表達cd47的患者中80.4%也存在cdc42高表達;在低表達cd47的患者中85.3%也存在cdc42低表達。表明cd47表達調(diào)節(jié)了cdc42的表達情況。為進一步驗證cd47通過cdc42調(diào)節(jié)細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲,我們利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染a549和nci-h520上調(diào)cd47的表達,再利用rna干擾技術(shù)下調(diào)cdc42表達,在微流控芯片轉(zhuǎn)移平臺內(nèi)觀察下調(diào)cdc42表達后細胞的侵襲轉(zhuǎn)移數(shù)量較未下調(diào)cdc42表達的對照組明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:1.通過westernblot和免疫組織化學(xué)染色檢測到非小細胞肺癌組織標(biāo)本的cd47表達癌組織明顯高于癌旁組織;cd47表達與患者轉(zhuǎn)移情況、臨床分期相關(guān),高表達cd47的患者臨床分期越差、更易出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移。因此提示cd47分子可以在非小細胞肺癌中判斷侵襲和轉(zhuǎn)移的一個指標(biāo)。2.成功構(gòu)建了可以模擬細胞侵襲轉(zhuǎn)移過程的微流控芯片轉(zhuǎn)移模型。在該芯片模型內(nèi)可以實現(xiàn)細胞的三維培養(yǎng)并對細胞的侵襲轉(zhuǎn)移數(shù)量進行實時的動態(tài)觀察,通過比較轉(zhuǎn)移細胞數(shù)量的差別來直觀驗證細胞的轉(zhuǎn)移能力。采用肺腺癌細胞株a549和肺鱗癌細胞株nci-h520作為研究對象,利用rna干擾技術(shù)和質(zhì)粒表達下調(diào)和上調(diào)兩種細胞株的cd47表達,觀察兩種細胞株在微流控芯片轉(zhuǎn)移模型內(nèi)處理前后細胞轉(zhuǎn)移數(shù)量的差異,證實cd47表達與細胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力中發(fā)揮重要作用。進一步在體內(nèi)成瘤以及轉(zhuǎn)移模型中亦證實下調(diào)CD47表達,A549細胞體內(nèi)成瘤和轉(zhuǎn)移能力均降低。說明CD47分子在判定非小細胞肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移現(xiàn)象中起到重要的作用。3.CD47在肺癌細胞株中表達水平的變化伴隨Cdc42分子的表達水平改變。在肺癌患者組織標(biāo)本中我們亦證實Cdc42表達水平與CD47表達相關(guān)。利用微流控芯片的轉(zhuǎn)移模型觀察到下調(diào)Cdc42表達可以干預(yù)CD47高表達所引起到細胞轉(zhuǎn)移性增加。這些結(jié)果初步闡明了Cdc42作為CD47的下游分子參與了腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程,為肺癌的轉(zhuǎn)移機制和臨床診治提供了有益的幫助。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：1723042