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CD47在非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)機(jī)制研究

發(fā)布時(shí)間:2018-04-08 19:27

  本文選題:CD47 切入點(diǎn):非小細(xì)胞肺癌 出處:《大連醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文


【摘要】:背景和目的:肺癌在我國(guó)發(fā)病率極高,據(jù)報(bào)道近十幾年肺癌分別占在我國(guó)男性和女性惡性腫瘤發(fā)病率的第一和第二位,并且發(fā)病年齡也出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)。其中非小細(xì)胞肺癌作為肺癌的一個(gè)大類發(fā)病率也逐年增高,近年來(lái)肺癌相關(guān)領(lǐng)域基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究及臨床診斷治療方法逐漸進(jìn)步,越來(lái)越多的肺癌患者得到了規(guī)范的治療,使得肺癌的診治率有了很大的提升,然而由于肺癌表現(xiàn)出較強(qiáng)的侵襲性,尤其是一旦肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移,患者即將面臨極高的死亡威脅。因此,總體來(lái)說(shuō),對(duì)肺癌的轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行控制仍然是肺癌領(lǐng)域需要解決的重要關(guān)鍵問(wèn)題。然而目前腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機(jī)制仍不清楚。為了探索腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機(jī)制,近年來(lái),CD47分子逐漸引起了大家的關(guān)注。其重要原因在于,研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可以表達(dá) 別吃我‖信號(hào),從而使得巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤吞噬作用減低,出現(xiàn)腫瘤對(duì)免疫逃逸現(xiàn)象,這種現(xiàn)象與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。而腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的CD47分子就是一種 別吃我‖信號(hào)分子。當(dāng)腫瘤細(xì)胞表面CD47分子與巨噬細(xì)胞的表面SIRPα分子組合成CD47-SIRPα信號(hào)復(fù)合體時(shí),導(dǎo)致巨噬細(xì)胞SIRPα分子的細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)中免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)發(fā)生磷酸化,因此可以傳導(dǎo)抑制性信號(hào)通路,即 別吃我‖信號(hào)來(lái)減少巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬活性,這樣便產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸現(xiàn)象。而且CD47高水平表達(dá)與血液系統(tǒng)惡性腫瘤和部分實(shí)體腫瘤的分化程度、轉(zhuǎn)移能力、生存率及預(yù)后密切相關(guān)。CD47與腫瘤相關(guān)性研究得到越來(lái)越多關(guān)注,然而CD47在肺癌表達(dá)及與轉(zhuǎn)移的相關(guān)性等研究未見相關(guān)報(bào)道。另一方面,除了研究者關(guān)注的CD47-SIRPα信號(hào)復(fù)合體引起的腫瘤免疫逃逸現(xiàn)象,另有研究者提出cd47與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用仍有其他機(jī)制參與其中,然而相關(guān)的機(jī)制研究甚少。因此,本研究亦將對(duì)cd47與轉(zhuǎn)移的相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行初步的探討。我們通過(guò)組織標(biāo)本和肺癌細(xì)胞株的cd47表達(dá)情況進(jìn)行分別檢測(cè),并利用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)分別對(duì)cd47與肺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性進(jìn)行分析驗(yàn)證。最后對(duì)cd47與肺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步探討。本研究分以下三部分進(jìn)行。研究方法:1.非小細(xì)胞肺癌組織cd47的表達(dá)及其臨床意義選取20例非小細(xì)胞肺癌者切除的手術(shù)標(biāo)本,利用westernblotting方法對(duì)癌及癌旁組織中的cd47表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法對(duì)80例非小細(xì)胞肺癌患者的石蠟組織切片對(duì)cd47表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)免疫組織化學(xué)評(píng)分將80例患者按照cd47表達(dá)水平分為低表達(dá)cd47組和高表達(dá)cd47組,利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的方法對(duì)不同cd47表達(dá)水平與病理分型、腫瘤分化程度及tnm分期等臨床病理特征進(jìn)行分析。2.cd47在nsclc侵襲轉(zhuǎn)移中的作用本部分研究分別從體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩方面進(jìn)行闡述。體外實(shí)驗(yàn)部分:首先利用westernblot、real-timepcr和細(xì)胞免疫熒光對(duì)不同肺癌細(xì)胞株的cd47表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。為驗(yàn)證cd47表達(dá)水平與細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系,我們構(gòu)建了基于微流控芯片技術(shù)的轉(zhuǎn)移模型。利用該模型我們可以對(duì)細(xì)胞在不同情況下的轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行實(shí)時(shí)的動(dòng)態(tài)觀察。利用rna干擾技術(shù)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)分別下調(diào)或上調(diào)肺腺癌細(xì)胞株a549和肺鱗癌細(xì)胞株nci-h520的cd47表達(dá),將進(jìn)行不同處理的各組細(xì)胞株分別注入微流控芯片轉(zhuǎn)移模型內(nèi)觀察72小時(shí)后細(xì)胞的轉(zhuǎn)移情況,分析不同cd47表達(dá)水平表現(xiàn)出的肺癌細(xì)胞體外轉(zhuǎn)移能力的差異和區(qū)別。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分:通過(guò)皮下注射構(gòu)建原位肺癌模型、通過(guò)尾靜脈注射構(gòu)建肺癌移植模型,同時(shí)利用shrna穩(wěn)定下調(diào)a549細(xì)胞的cd47表達(dá),觀察在兩種動(dòng)物模型中不同cd47表達(dá)的a549細(xì)胞的原位成瘤以及腫瘤轉(zhuǎn)移情況,進(jìn)一步驗(yàn)證cd47與肺癌發(fā)展轉(zhuǎn)移的影響。3.cd47促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的初步探討為探討cdc42作為cd47的下游分子參與非小細(xì)胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移我們進(jìn)行以下研究,利用westernblot方法檢測(cè)不同肺癌細(xì)胞株cd47和cdc42的表達(dá)情況;通過(guò)rna干擾技術(shù)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)分別下調(diào)或上調(diào)肺腺癌細(xì)胞株a549和肺鱗癌細(xì)胞株nci-h520的cd47表達(dá),進(jìn)一步觀察cd47表達(dá)水平變化是否伴隨cdc42表達(dá)改變。上調(diào)cd47表達(dá)的a549和nci-h520細(xì)胞株再利用rna干擾技術(shù)下調(diào)cdc42表達(dá)后觀察不同處理情況的細(xì)胞株在微流控芯片轉(zhuǎn)移平臺(tái)內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的情況。最后對(duì)80例非小細(xì)胞肺癌患者的石蠟切片cd47表達(dá)與cdc42表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果:1.非小細(xì)胞肺癌組織cd47的表達(dá)及其臨床意義利用westernblotting蛋白檢測(cè)方法對(duì)20例非小細(xì)胞肺癌患者的手術(shù)切除組織標(biāo)本的癌及癌旁組織中cd47表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)癌組織的cd47表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(p0.05)。同時(shí)采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法對(duì)80例非小細(xì)胞肺癌患者的石蠟切片對(duì)cd47表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果亦證實(shí)癌組織cd47表達(dá)明顯高于癌旁組織,對(duì)不同患者的cd47表達(dá)水平進(jìn)行分組,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)cd47與tnm分期密切相關(guān),高表達(dá)cd47的患者更易出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;另外高表達(dá)cd47與臨床分期亦相關(guān),高表達(dá)cd47的患者臨床分期越差。提過(guò)提示cd47表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān),對(duì)cd47的表達(dá)檢測(cè)將對(duì)臨床轉(zhuǎn)移和預(yù)后的判斷具有重要意義。2.cd47在nsclc侵襲轉(zhuǎn)移中的作用為了在體外觀察驗(yàn)證細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力,我們成功構(gòu)建了基于微流控芯片技術(shù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型。利用該模型我們可以實(shí)時(shí)對(duì)不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。為了更加全面驗(yàn)證的cd47在nsclc侵襲轉(zhuǎn)移中的作用,我們分別選取了肺腺癌細(xì)胞株a549和肺鱗癌細(xì)胞株nci-h520分別進(jìn)行檢測(cè)分析。利用rna干擾技術(shù)成功將a549和nci-h520的cd47表達(dá)水平下調(diào),進(jìn)而將未處理和下調(diào)cd47表達(dá)的a549和nci-h520細(xì)胞分別注入微流控芯片轉(zhuǎn)移模型內(nèi),觀察72小時(shí)后細(xì)胞的轉(zhuǎn)移情況,結(jié)果證實(shí)在下調(diào)cd47表達(dá)的a549和nci-h520細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)量較對(duì)照組明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。為進(jìn)一步驗(yàn)證,我們利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染a549和nci-h520細(xì)胞穩(wěn)定上調(diào)cd47表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在上調(diào)cd47表達(dá)后a549和nci-h520的細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)量明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察,穩(wěn)定下調(diào)cd47表達(dá)的a549組6只裸鼠的皮下成瘤體積大小較a549組明顯減小;在尾靜脈注射轉(zhuǎn)移模型小鼠中同樣觀察到穩(wěn)定下調(diào)cd47表達(dá)的a549組形成的肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量少于a549組。3.cd47促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的初步探討通過(guò)westernblot檢測(cè)了不同肺癌細(xì)胞株cd47蛋白表達(dá)與cdc42蛋白表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在高表達(dá)cd47的細(xì)胞株中cdc42也呈高表達(dá),反之亦然。為驗(yàn)證cdc42作為cd47的下游分子參與了肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,我們對(duì)a549和nci-h520分別下調(diào)或上調(diào)cd47表達(dá),利用westernblot檢測(cè)了cdc42的蛋白表達(dá)情況,結(jié)果表明cd47表達(dá)水平的變化伴隨了cdc42表達(dá)水平的改變。對(duì)80例肺癌患者對(duì)組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色觀察,發(fā)現(xiàn)在高表達(dá)cd47的患者中80.4%也存在cdc42高表達(dá);在低表達(dá)cd47的患者中85.3%也存在cdc42低表達(dá)。表明cd47表達(dá)調(diào)節(jié)了cdc42的表達(dá)情況。為進(jìn)一步驗(yàn)證cd47通過(guò)cdc42調(diào)節(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲,我們利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染a549和nci-h520上調(diào)cd47的表達(dá),再利用rna干擾技術(shù)下調(diào)cdc42表達(dá),在微流控芯片轉(zhuǎn)移平臺(tái)內(nèi)觀察下調(diào)cdc42表達(dá)后細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移數(shù)量較未下調(diào)cdc42表達(dá)的對(duì)照組明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:1.通過(guò)westernblot和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)到非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本的cd47表達(dá)癌組織明顯高于癌旁組織;cd47表達(dá)與患者轉(zhuǎn)移情況、臨床分期相關(guān),高表達(dá)cd47的患者臨床分期越差、更易出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此提示cd47分子可以在非小細(xì)胞肺癌中判斷侵襲和轉(zhuǎn)移的一個(gè)指標(biāo)。2.成功構(gòu)建了可以模擬細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程的微流控芯片轉(zhuǎn)移模型。在該芯片模型內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的三維培養(yǎng)并對(duì)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移數(shù)量進(jìn)行實(shí)時(shí)的動(dòng)態(tài)觀察,通過(guò)比較轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)量的差別來(lái)直觀驗(yàn)證細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。采用肺腺癌細(xì)胞株a549和肺鱗癌細(xì)胞株nci-h520作為研究對(duì)象,利用rna干擾技術(shù)和質(zhì)粒表達(dá)下調(diào)和上調(diào)兩種細(xì)胞株的cd47表達(dá),觀察兩種細(xì)胞株在微流控芯片轉(zhuǎn)移模型內(nèi)處理前后細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)量的差異,證實(shí)cd47表達(dá)與細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步在體內(nèi)成瘤以及轉(zhuǎn)移模型中亦證實(shí)下調(diào)CD47表達(dá),A549細(xì)胞體內(nèi)成瘤和轉(zhuǎn)移能力均降低。說(shuō)明CD47分子在判定非小細(xì)胞肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移現(xiàn)象中起到重要的作用。3.CD47在肺癌細(xì)胞株中表達(dá)水平的變化伴隨Cdc42分子的表達(dá)水平改變。在肺癌患者組織標(biāo)本中我們亦證實(shí)Cdc42表達(dá)水平與CD47表達(dá)相關(guān)。利用微流控芯片的轉(zhuǎn)移模型觀察到下調(diào)Cdc42表達(dá)可以干預(yù)CD47高表達(dá)所引起到細(xì)胞轉(zhuǎn)移性增加。這些結(jié)果初步闡明了Cdc42作為CD47的下游分子參與了腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程,為肺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制和臨床診治提供了有益的幫助。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】:大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2016
【分類號(hào)】:R734.2

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7 邱晨;影響非小細(xì)胞肺癌手術(shù)后遠(yuǎn)期生存的相關(guān)因素分析[D];山東大學(xué);2015年

8 姜遠(yuǎn)矚;術(shù)前血液學(xué)指標(biāo)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后關(guān)系的研究[D];山東大學(xué);2015年

9 朱良明;STAT3及其靶基因?qū)Ψ切〖?xì)胞肺癌生物學(xué)行為調(diào)控機(jī)制的初步實(shí)驗(yàn)研究[D];山東大學(xué);2015年

10 周菊;HPV-16感染對(duì)非小細(xì)胞肺癌和A549細(xì)胞的影響及miRNAs表達(dá)改變的研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王勇;誘導(dǎo)型一氧化氮合酶在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的臨床意義[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2006年

2 陳婷;非小細(xì)胞肺癌調(diào)強(qiáng)放射治療預(yù)后因素分析[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

3 王波;單向式全胸腔鏡下解剖性肺葉切除術(shù)治療早期非小細(xì)胞肺癌的學(xué)習(xí)曲線[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

4 施桂清;血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合放化療治療非小細(xì)胞肺癌的療效及安全性研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

5 王靜;Eg5、Ki-67在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

6 覃建穎;IL-21和Tc1細(xì)胞在非小細(xì)胞肺癌患者外周血及癌灶中的變化及相互作用[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2015年

7 張瑞;ⅢA-N2期非小細(xì)胞肺癌手術(shù)治療和放射治療的療效對(duì)比及相關(guān)預(yù)后因素的分析[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

8 石姣姣;基于多肽構(gòu)建抗腫瘤靶向藥物的應(yīng)用研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

9 胡世霖;非小細(xì)胞肺癌中醫(yī)辨證分型與Napsin A、TTF-1在肺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性研究[D];福建中醫(yī)藥大學(xué);2015年

10 王婷婷;細(xì)胞因子活化殺傷細(xì)胞治療非小細(xì)胞肺癌臨床研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年



本文編號(hào):1723042

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