本文選題：TOPK　切入點(diǎn)：Src　出處：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的：TOPK作為一種絲／蘇氨酸蛋白激酶,在多種腫瘤中呈高表達(dá),并能促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生,但其激活機(jī)制尚不清楚。Src的活性在80%的結(jié)腸癌中有增強(qiáng),且TOPK存在Src磷酸化保守序列。本研究將探索Src是否為TOPK的直接上游激酶,并確認(rèn)其磷酸化位點(diǎn),制備磷酸化抗體探討TOPK被Src磷酸化后在結(jié)腸癌發(fā)生中的作用及其機(jī)制。方法：1.通過體外激酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Src是否可磷酸化TOPK,利用NetPhos2.0軟件及肽譜磷酸化方法篩選出其可被磷酸化的位點(diǎn)。2.制備相應(yīng)的磷酸化抗體(p-TOPK(Y74)、p-TOPK(Y272)),構(gòu)建TOPKY74、Y272單突變和Y74Y272雙突變?cè)吮磉_(dá)質(zhì)粒,并表達(dá)蛋白,通過體外激酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Src在Y74、Y272磷酸化TOPK。3.利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀測(cè)Src是否與TOPK共定位,并通過pull-down技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Src是否與TOPK共結(jié)合。4.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA-TOPK和pcDNA4-His-Src到HEK293T細(xì)胞,EGF刺激后,通過western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p-TOPK (Y74)的表達(dá)情況。5.在結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)分別給予EGF時(shí)間依賴性刺激,用Src抑制劑達(dá)沙替尼作用以及建立src基因沉默穩(wěn)定細(xì)胞系,用磷酸化抗體驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)Src可在Y74磷酸化TOPK。6.構(gòu)建TOPKY74、Y272單突變和Y74Y272雙突變真核表達(dá)質(zhì)粒,在JB6和SW480細(xì)胞建立TOPK單突變和雙突變穩(wěn)定細(xì)胞系,通過生長曲線檢測(cè)細(xì)胞的增殖變化,利用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)位點(diǎn)突變后細(xì)胞的錨定非依賴性生長能力(即克隆形成能力)的改變。7.在TOPK野生型和雙突變型JB6穩(wěn)定細(xì)胞系(JB6/WT和JB6/FF),敲除Src后的MEF細(xì)胞系(Src+/+和Src-/-)及達(dá)沙替尼作用后的結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480、HCT15及HCT116中用western blot法檢測(cè)TOPK的底物p-Histone H3 (S10)的表達(dá),觀察TOPK的活性變化情況。8.將建立的TOPK野生型和雙突變型SW480穩(wěn)定細(xì)胞系細(xì)胞(SW480/WT/和SW480/FF)注射入裸鼠體內(nèi),通過裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FF/SW480細(xì)胞成瘤能力的變化情況。9.在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)Src、TOPK及泛素分子Ubiquitin,通過免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TOPK泛素化結(jié)合能力的變化情況。10.用放線菌酮(CHX)分別作用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染野生型TOPK (TOPK-WT)和雙突變型TOPK(TOPK-FF)的HEK293T細(xì)胞以及Src+/+和Src-/- MEFs, western blot法檢測(cè)TOPK的半衰期。結(jié)果：1.體外激酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示活性Src可磷酸化無活性TOPK。NetPhos2.0軟件打分預(yù)測(cè)和肽譜磷酸化篩選出Y74和Y272為Src磷酸化TOPK的酪氨酸位點(diǎn)。2.體外激酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證制備的p-TOPK (Y74)抗體識(shí)別TOPK第Y74位點(diǎn)的磷酸化。3.激光共聚焦結(jié)果顯示Src在細(xì)胞內(nèi)與TOPK共定位,pull-down結(jié)果表明Ni-NTA-His-TOPK可結(jié)合細(xì)胞內(nèi)Src。4.共轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA-TOPK和pcDNA4-His-Src到HEK293T細(xì)胞后,p-TOPK (Y74)抗體能識(shí)別磷酸化的TOPK,并且EGF刺激增強(qiáng)了p-TOPK(Y74)的表達(dá)。5.分別用EGF刺激結(jié)腸癌細(xì)胞SW480 0,5,15,30分鐘后,內(nèi)源性p-TOPK(Y74)的表達(dá)水平增強(qiáng)；用Src抑制劑達(dá)沙替尼作用于結(jié)腸癌細(xì)胞24h或者沉默結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)Src后,內(nèi)源性p-TOPK (Y74)的表達(dá)水平降低。6.在過表達(dá)TOPK野生型(WT)、單突變(74F；272F)和雙突變(FF)的JB6和SW480細(xì)胞系中,各突變組細(xì)胞生長較野生型組慢(P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),并且突變組細(xì)胞的錨定非依賴性生長能力較野生型組降低,即突變后細(xì)胞的腫瘤發(fā)生能力下降。7.與JB6/WT組相比較,JB6/FF組細(xì)胞p-Histone H3 (S10)的表達(dá)明顯降低；而在Src-/- AMEFs和達(dá)沙替尼作用后的結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480、HCT15以及HCT116中,p-Histone H3 (S10)的表達(dá)也降低,Src磷酸化TOPK增強(qiáng)了TOPK的活性。8.裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)顯示SW480/FF組腫瘤增長速度明顯減慢(P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),最終形成的腫瘤體積也明顯較SW480/WT組小,并且SW480/FF組腫瘤中p-Histone H3(S 10)的表達(dá)水平明顯低于SW480/WT組。9.共轉(zhuǎn)染Src后,TOPK的泛素化結(jié)合水平明顯降低,說明Src抑制了TOPK的泛素化誘導(dǎo)的降解途徑。10. TOPK-FF組細(xì)胞中TOPK的半衰期較TOPK-WT短；Src"-/- MEFs中TOPK的穩(wěn)定性也較Src+/+ MEFs差,說明Src增強(qiáng)TOPK的穩(wěn)定性。結(jié)論：Src在Y74、Y272磷酸化TOPK,增強(qiáng)其活性和穩(wěn)定性,從而促進(jìn)了結(jié)腸癌的發(fā)生。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect and mechanism of TOPK on the phosphorylation of TOPK in colon cancer cells . In addition , EGF stimulated the expression of p - TOPK ( Y74 ) . 5 . The expression level of endogenous p - TOPK ( Y74 ) was enhanced after 5 , 15 and 30 minutes respectively with EGF - stimulated colon cancer cells SW480 0 , 5 , 15 and 30 minutes .
The expression level of endogenous p - TOPK ( Y74 ) was decreased after 24 h or silent colon cancer cells in colon cancer cells . 6 . After overexpression of TOPK wild - type ( WT ) and single mutation ( 74F ) , the level of endogenous p - TOPK ( Y74 ) decreased .
In the JB6 and SW480 cell lines of 272F ) and double mutation ( FF ) , the cell growth of each mutant group was slower than that in the wild type group ( P0.05 , the difference was statistically significant ) , and the anchoring non - dependent growth capacity of the mutant group cells was lower than that in the wild type group , that is , the capacity of the tumor of the mutant cells decreased . 7 . Compared with the JB6 / WT group , the expression of p - Histone H3 ( S10 ) in the JB6 / FF group was obviously reduced ;
The expression of p - Histone H3 ( S10 ) in SW480 / FF group decreased significantly ( P0.05 ) . The half - life of TOPK in TOPK - FF group was shorter than that of TOPK - WT ;
The stability of TOPK was also lower than that of src + / + MEFs , which indicated that the stability of TOPK was enhanced . Conclusion : In Y74 and Y272 , the activity and stability of TOPK were enhanced , and the occurrence of colon cancer was promoted .

【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.35

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本文編號(hào)：1714209