發(fā)布時間：2018-04-05 00:36

  本文選題：乳腺癌　切入點(diǎn)：UBE3A　出處：《川北醫(yī)學(xué)院》2015年碩士論文

【摘要】：第一部分RNAi阻低UBE3A后對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生物學(xué)行為的影響目的:通過sh RNA及慢病毒載體阻低UBE3A的表達(dá)后,觀察乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231生物學(xué)行為的變化,以探討UBE3A在乳腺癌細(xì)胞中的作用。方法:構(gòu)建3條干擾UBE3A基因的表達(dá)載體UBE3A-sh RNA1、UBE3A-sh RNA2、UBE3A-sh RNA3和1條無關(guān)序列作為陰性對照Negative-sh RNA;在脂質(zhì)體lipo2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)化293T細(xì)胞,包裝產(chǎn)生慢病毒載體,再將慢病毒載體轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231;熒光定量PCR檢測UBE3A的干擾效率,篩選出干擾效率最高的干擾片段;Western blotting檢測各組細(xì)胞UBE3A蛋白水平上的阻低情況;Transwell小室侵襲實驗檢測UBE3A阻低后,MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測阻低UBE3A后,MDA-MB-231細(xì)胞周期情況;CCK-8試劑盒法檢測阻低UBE3A后,MDA-MB-231細(xì)胞在24h、48h、72h增殖能力變化;對結(jié)果采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意。結(jié)果:成功構(gòu)建及篩選出了干擾率最高的慢病毒載體LV-UBE3A-sh RNA;Q-PCR、Western blotting結(jié)果顯示:相對空白組和陰性對照組,UBE3A阻低組UBE3A基因和蛋白表達(dá)均受到抑制,抑制率分別為89.5%、45.3%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),空白組和陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);CCK-8實驗及Transwell小室侵襲實驗結(jié)果顯示:UBE3A阻低組與空白對照組及陰性對照組相比較,MDA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲能力均受抑制,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),空白組與陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:阻低UBE3A組與空白對照組及陰性對照組MDA-MB-231細(xì)胞各周期差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),且阻低UBE3A組主要變化集中在S期,空白組與陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:UBE3A阻低后,MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞周期以及細(xì)胞的侵襲能力等生物學(xué)行為發(fā)生明顯變化,提示UBE3A在乳腺癌細(xì)胞中扮演著重要角色,其可能是乳腺癌治療的一個潛在靶標(biāo)。第二部分阻低UBE3A后對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生物學(xué)行為影響的機(jī)制研究目的:通過2-DE為基礎(chǔ)的差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法觀察UBE3A阻低前后乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231蛋白質(zhì)的表達(dá)差異,探討UBE3A對乳腺癌生物學(xué)行為影響的機(jī)制。方法:采用2-DE方法對UBE3A阻低前后MDA-MB-231細(xì)胞的總蛋白進(jìn)行分離,PDQuest 7.1軟件進(jìn)行分析獲得差異蛋白質(zhì),然后使用串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-TOF-MS/MS)對差異蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定;采用DAVID Functional Annotation及String在線工具分析差異表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞成分、生物學(xué)途徑、分子功能及其之間的相互關(guān)系。結(jié)果:2-DE及串聯(lián)質(zhì)譜鑒定出阻低UBE3A前后28個差異蛋白質(zhì)點(diǎn),其中有4個蛋白質(zhì)在阻低UBE3A組中相對高表達(dá),24個相對低表達(dá),除去鑒定相同的蛋白質(zhì)后有24個差異蛋白質(zhì),與DAVID數(shù)據(jù)庫有23個相匹配;DAVID Functional Annotation進(jìn)行GO分類,能夠進(jìn)行生物學(xué)途徑、細(xì)胞成分、分子功能注釋分類的蛋白質(zhì)分別為23(100%)、20(87.7%)和23(100%),而在泛素-蛋白酶體系統(tǒng)及糖代謝方面分類比較明確;String分析顯示這些差異蛋白中有23個存在直接或間接的聯(lián)系。結(jié)論:23個差異蛋白質(zhì)之間存在著直接或間接的聯(lián)系,特別在泛素-蛋白酶體系統(tǒng)功能及糖代謝功能方面發(fā)生變化,這可能是阻低UBE3A后乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為改變的原因。
[Abstract]:The first part influence on the biological behavior of human breast cancer cell line MDA-MB-231 RNAi UBE3A low resistance Objective: the expression of SH after RNA and lentiviral vector resistance is low after UBE3A, to observe the change of biological behavior of breast cancer cell line MDA-MB-231, to investigate the role of UBE3A in breast cancer cells. Methods: the construction of 3 interference UBE3A gene expression UBE3A-sh RNA2, carrier UBE3A-sh RNA1, UBE3A-sh RNA3 and 1 unrelated sequence as negative control Negative-sh RNA; transformation of 293T cells mediated by liposome lipo2000, packaged lentivirus vector, then lentiviral vector transfected into human breast cancer cell line MDA-MB-231; interference efficiency of fluorescence quantitative PCR detection of UBE3A, screening out the interference fragment the highest interference efficiency; Western blotting cells were detected with UBE3A protein levels on the low resistance; Transwell chamber invasion assay UBE3A low resistance after the invasion of MDA-MB-231 cells The ability to change; flow cytometry was used to detect the resistance of low UBE3A, MDA-MB-231 cell cycle; CCK-8 kit method was used to detect the resistance of low UBE3A, MDA-MB-231 cells in 24h, 48h, 72h changes in proliferation ability; using SPSS 22 statistical analysis of the results by P0.05 were statistically. Results: the successful construction and selected interference rate of lentiviral vector of LV-UBE3A-sh RNA Q-PCR Western blotting, the highest; the results showed that: the relative control group and negative control group, low UBE3A group expression of UBE3A gene and protein resistance were inhibited, the inhibition rates were 89.5%, 45.3%, the difference was statistically significant (P0.05), blank control group and negative control group no statistical significance (P0.05); CCK-8 assay and Transwell invasion assay showed that: UBE3A low resistance group and blank control group and negative control group compared to MDA-MB-231 cell proliferation and invasion were inhibited, with differences There was statistical significance (P0.05), the control group and negative control group had no significant difference (P0.05); flow cytometry results showed that the resistance of the low UBE3A group and blank control group and negative control group MDA-MB-231 cells in each cycle. The difference was statistically significant (P0.05), and the resistance of the low UBE3A group mainly concentrated in the change of S phase. The blank control group and negative control group had no significant difference (P0.05). Conclusion: UBE3A resistance is low, the proliferation of MDA-MB-231 cells, significant changes in the biological behavior of cell cycle and cell invasion, suggesting that UBE3A plays an important role in breast cancer cells, which may be a potential target for the treatment of breast cancer the purpose of research on the mechanism of resistance. The second part is low after UBE3A on the biological behavior of breast cancer cell MDA-MB-231 effect: by the difference of 2-DE based proteomics method to observe the UBE3A low resistance before and after breast cancer cell line MDA- The differential expression of MB-231 protein, investigate the mechanism of effect of UBE3A on the biological behavior of breast cancer. Methods: using the 2-DE method of total protein of UBE3A low resistance MDA-MB-231 cells before and after the separation, PDQuest 7.1 was used to analyze the obtained proteins, then using tandem mass spectrometry (MALDI-TOF-TOF-MS/MS) were used to identify the differential proteins; expression analysis of cellular constituents, protein using DAVID Functional Annotation and String online tools for biological pathways, the relationship between the molecular function and tandem mass spectrometry. Results: 2-DE and UBE3A low resistance before and after identified 28 differential protein spots, including 4 protein in low resistance group UBE3A relatively high expression, 24 relatively low expression, remove the identification of the same protein there are 24 different proteins, there are 23 matches with the DAVID DAVID Functional Annotation database; GO class, can enter For biological pathways, cellular component, molecular function annotation classification protein were 23 (100%), 20 (87.7%) and 23 (100%), and in the ubiquitin proteasome system and glucose metabolism classification clear; String analysis showed that these proteins have 23 direct links are directly or indirectly. Conclusion: there is a direct or indirect contact between the 23 proteins, especially in function and glucose metabolism function of the ubiquitin proteasome system changes, which is probably the reason why the change of biological behavior of breast cancer cell lines after UBE3A low resistance.

【學(xué)位授予單位】：川北醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

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本文編號：1712440