本文選題：苦參堿衍生物　切入點(diǎn)：肝細(xì)胞癌　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：【研究背景及目的】肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)位列全球癌癥死亡的第三位。肝癌晚期患者主要采用放射治療和化學(xué)藥物治療,然而這些方法只能在治療初期給患者帶來(lái)良好的效用,隨之而來(lái)的是毒性、耐藥反應(yīng),復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等不良反應(yīng)。為了降低HCC的死亡率并提高患者治療后的生活質(zhì)量,人們已經(jīng)做了許多的努力,但是到目前為止依然沒(méi)有找到令人滿意的治療方法。越來(lái)越多的證據(jù)表明,腫瘤中存在的一小部分細(xì)胞稱之為腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell,CSC),這些CSC是腫瘤形成、生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的根源,也是新型腫瘤治療的靶細(xì)胞。研究表明,HCC中的肝癌干細(xì)胞可以通過(guò)干細(xì)胞表面標(biāo)志物(如Ep CAM、CD133、CD90和CD44)來(lái)分離和鑒定;在體外可形成球體懸浮生長(zhǎng),類似于干細(xì)胞也有自我更新和分化的能力,并且對(duì)放射治療和化療藥物耐受;體內(nèi)CSC具有高致瘤性,接種很少的細(xì)胞就能形成肝癌。CSCs自我更新和分化,受到Wnt/β-catenin、Hedgehog和Notch等多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的調(diào)控。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在肝臟代謝和肝再生過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,而Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常會(huì)促使腫瘤發(fā)生、腫瘤侵襲和治療耐受等。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)CSC標(biāo)志物的抗體或利用RNA干擾技術(shù)敲減CSC標(biāo)志物,能單獨(dú)或者聯(lián)合化療藥物抑制動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的形成、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。此外,一些能抑制CSC的小分子也有類似的作用�？鄥A(matrine)是從中藥苦參中提取出來(lái)的一種主要的生物堿,具有抗腫瘤、抗纖維化、抗炎和抗病毒等藥理學(xué)活性�？鄥A的缺點(diǎn)在于效能太低并且半衰期短,為此,我們課題組以槐果堿為起始化合物,通過(guò)硫代把苦參堿結(jié)構(gòu)中的羰基氧替換為硫原子,并在雙鍵位置通過(guò)側(cè)鏈加成引入了氨基團(tuán),半合成了一系列硫代苦參堿衍生物。經(jīng)藥理活性篩選發(fā)現(xiàn),這些衍生物的抗炎、抗纖維化和抗腫瘤活性比苦參堿或槐果堿強(qiáng)約100倍。后續(xù)作用機(jī)制研究表明,苦參堿衍生物能抑制肝癌細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等炎癥細(xì)胞AKT/GSK3β、MAPK和NFκB等信號(hào)通路,更有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)苦參堿及其衍生物還能結(jié)合核糖體蛋白S5(ribosomal protein S5,RPS5),并介導(dǎo)其抗肝纖維化作用。新近,我們又發(fā)現(xiàn)它們還能特異性結(jié)合細(xì)胞膜上核糖體蛋白家族中的另一成員層粘連蛋白(laminin)受體(67KD laminin receptor,67LR)。67LR由核糖體蛋白SA(RPSA)編碼,最初發(fā)現(xiàn)為層粘連蛋白的結(jié)合蛋白,具有促進(jìn)細(xì)胞粘附、遷移、歸巢、增殖、分化和極化等許多重要的生物學(xué)功能,與腫瘤轉(zhuǎn)移、神經(jīng)退行性疾病和發(fā)育異常等有著緊密的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)67LR在多種腫瘤組織中高表達(dá)。綠茶提取物表沒(méi)食子酸鹽(epigallocatechin gallate,EGCG)是目前發(fā)現(xiàn)的唯一的67LR配體,可能是67LR的激動(dòng)劑或變構(gòu)劑,但專特性不強(qiáng),細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)眾多,具有廣泛的藥理學(xué)活性。研究表明,67LR抗體可阻斷EGCG的抗腫瘤作用,說(shuō)明EGCG作用于細(xì)胞膜上67LR,但是,EGCG作用于67LR的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路目前仍不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)EGCG與67LR受體結(jié)合后,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)活性或激活A(yù)kt通路促使e NOS磷酸化和NO釋放,升高細(xì)胞內(nèi)cGMP。WM130是新型苦參堿衍生物中藥理活性較強(qiáng)、毒性較低的一個(gè)衍生物,本課題我們選擇苦參堿衍生物WM130研究其抗HCC的作用及其機(jī)制。迄今為止,苦參堿衍生物對(duì)肝癌干細(xì)胞的作用以及其抗肝癌作用與67LR的關(guān)系國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。我們證實(shí)了苦參堿衍生物WM130能在體外抑制肝癌細(xì)胞增殖和克隆形成,并且在體內(nèi)抑制HCC生長(zhǎng)。WM130還能優(yōu)先抑制肝癌細(xì)胞系和成瘤模型組織中肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞,其作用機(jī)制主要由Wnt/β-catenin信號(hào)通路介導(dǎo)。WM130部分通過(guò)67LR達(dá)到抗HCC的作用�！緦�(shí)驗(yàn)方法】一、苦參堿衍生物WM130對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和克隆形成的作用研究1、肝癌細(xì)胞MHCC-LM3、Hep3B和MHCC-97H以3×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中,24小時(shí)后加入不同濃度WM130處理72小時(shí),CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,并計(jì)算半抑制濃度(50%inhibiting concentration,IC50)。2、MHCC-LM3、Hep3B和MHCC-97H以1×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中,24小時(shí)后加入不同濃度的WM130處理17-21天(每3-5天更換新的培養(yǎng)基),平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力,拍照并統(tǒng)計(jì)克隆數(shù)(聚集大于50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞群算作一個(gè)克隆)。二、苦參堿衍生物WM130對(duì)肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的作用研究(一)WM130對(duì)多柔比星耐藥的肝癌細(xì)胞的作用Hep3B和MHCC-LM3用2μmol/L多柔比星(Doxorubicin,DOX)預(yù)處理(以下表示為Hep3B-DOXR和LM3-DOXR細(xì)胞)5天后,加入WM130(0、2、10、20μmol/L)或DOX(2μmol/L)培養(yǎng)72小時(shí),CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物Ep CAM陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)目。(二)WM130對(duì)肝癌干細(xì)胞和肝細(xì)胞功能相關(guān)基因表達(dá)的影響WM130(0、2、10、20μmol/L)與Hep3B和MHCC-LM3孵育24小時(shí)后,實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)肝癌干細(xì)胞相關(guān)基因Ep CAM、CD133、CD90、Oct3/4、Sox2和NANOG以及正常肝細(xì)胞功能相關(guān)基因CYP1A3、G-6-P、ALB和ALDOB的表達(dá)水平。(三)WM130對(duì)肝癌細(xì)胞成球能力的影響1、選用無(wú)血清懸浮成球培養(yǎng)的方法富集肝癌細(xì)胞中的球體細(xì)胞(肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞)。收集MHCC-LM3、Hep3B和MHCC-97H球體細(xì)胞,室溫下用0.25%胰酶消化細(xì)胞3分鐘,含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化,收集細(xì)胞懸液(第一代球體細(xì)胞),供以下實(shí)驗(yàn)使用。球體細(xì)胞加入抗體,避光混勻后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá)肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物Ep CAM和CD133的細(xì)胞數(shù)目。2、第一代球體細(xì)胞以1×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔低吸附板中,加入WM130(0-20μmol/L)培養(yǎng)7天,倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)球體細(xì)胞(直徑30μm)的數(shù)量,并拍攝照片觀察球體的大小;第一代球體細(xì)胞用胰酶消化為單細(xì)胞懸液后,以1×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔低吸附板中,不加WM130處理使其繼續(xù)生長(zhǎng)7天,連續(xù)培養(yǎng)兩代,統(tǒng)計(jì)第二、三代球體細(xì)胞的數(shù)量。3、Hep3B球體細(xì)胞用10μmol/L WM130處理4天后,再用無(wú)藥培養(yǎng)基培養(yǎng)4天,然后用胰酶消化為單個(gè)細(xì)胞后,皮下注射裸鼠,1×105個(gè)細(xì)胞/只。為了避免個(gè)體差異,空白對(duì)照球體細(xì)胞以同樣數(shù)量皮下注射同一只裸鼠的另一側(cè),測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)大小至45天,免疫組化(immunohistochemical,IHC)檢測(cè)瘤塊中Ep CAM的表達(dá)水平。三、苦參堿衍生物WM130對(duì)肝癌球體細(xì)胞的優(yōu)先作用用WM130(0、2、10、20μmol/L)或DOX(0、1、2、5μmol/L)分別處理肝癌細(xì)胞和球體細(xì)胞后,檢測(cè)細(xì)胞增殖情況和克隆形成能力,比較藥物對(duì)兩種細(xì)胞作用的差別;肝癌細(xì)胞和球體細(xì)胞用10μmol/L WM130處理后,RT-PCR檢測(cè)肝癌干細(xì)胞相關(guān)基因Ep CAM、CD133和Oct3/4表達(dá)水平。四、苦參堿衍生物WM130體內(nèi)對(duì)肝細(xì)胞癌生長(zhǎng)的作用研究(一)WM130對(duì)肝癌細(xì)胞異種移植瘤生長(zhǎng)的影響裸鼠皮下接種MHCC-LM3(1×106個(gè)細(xì)胞/只),然后隨機(jī)將裸鼠分為4組:對(duì)照組(給予生理鹽水)、WM130組(20mg/kg,每天灌胃)、多柔比星組(6mg/kg,每周腹腔注射一次)和WM130+DOX聯(lián)合用藥組。每2-3天使用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積,并觀察每組裸鼠體重的變化,三周后處死裸鼠,取出瘤塊組織并稱重。(二)WM130體內(nèi)對(duì)肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的作用腫瘤組織一部分剪碎,使用胰酶消化為單個(gè)細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng),用于之后的成球?qū)嶒?yàn)、平板克隆和單藥耐藥實(shí)驗(yàn),剩余的組織用于IHC、RT-PCR和蛋白免疫印跡(western blot)實(shí)驗(yàn)。五、苦參堿衍生物WM130對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用研究(一)WM130體外對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用Hep3B和MHCC-LM3用WM130(0、2、10、20μmol/L)處理4天后,western blot方法檢測(cè)相關(guān)蛋白β-catenin、cyclin D1、GSK3β和p-GSK3β(ser9)的表達(dá)水平。(二)WM130體內(nèi)對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用IHC和western blot方法檢測(cè)MHCC-LM3異種移植瘤塊中相關(guān)蛋白β-catenin、Ep CAM、GSK3β和p-GSK3β(ser9)的表達(dá)水平。六、苦參堿衍生物WM130抗肝細(xì)胞癌作用與67LR的關(guān)系研究(一)抗體封閉67LR表達(dá)水平對(duì)WM130抑制肝癌細(xì)胞增殖的影響Hep3B和MHCC-LM3用20mg/m L 67LR(MLu C5)抗體及其同型對(duì)照Ig M(20mg/m L)抗體在37℃5%CO2孵箱中封閉1小時(shí)后,回收抗體,再加入EGCG(40μmol/L)或WM130(0、10、20、40μmol/L)處理72小時(shí),CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。(二)敲減67LR表達(dá)水平對(duì)WM130抑制肝癌細(xì)胞增殖的影響67LR小干擾RNA(67LR si RNA)轉(zhuǎn)染Hep3B和MHCC-LM3 48小時(shí)后,或用sh67LR慢病毒構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞系后,加入WM130(0、10、20、40μmol/L)處理72小時(shí),CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。(三)EGCG對(duì)WM130抑制肝癌細(xì)胞增殖的影響EGCG(20μmol/L)和WM130(0、10、20、40μmol/L)共同處理MHCC-LM3和Hep3B 72小時(shí),CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。(四)磷酸二酯酶5抑制劑對(duì)WM130抑制肝癌細(xì)胞增殖的影響磷酸二酯酶5(PDE5)抑制劑西地那非(Sildenafil,20μmol/L)和EGCG(20μmol/L)或WM130(0、10、20、40μmol/L)共同處理MHCC-LM3 72小時(shí),CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。(五)蛋白磷酸酶2A抑制劑對(duì)WM130抑制肝癌細(xì)胞增殖的影響1、蛋白磷酸酶2A(PP2A)抑制劑岡田軟海綿酸(okadaic acid,OA)(0、5、10、20、40、100n M)處理Hep3B和MHCC-LM3 3小時(shí)后,再加入20μmol/L WM130和40μmol/L EGCG繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí),CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。2、Hep3B和MHCC-LM3用10n M OA預(yù)處理3小時(shí)后,再加入WM130(0、10、20、40μmol/L)或EGCG(0、10、20、40μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí),CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況�！緦�(shí)驗(yàn)結(jié)果】一、苦參堿衍生物WM130抑制肝癌細(xì)胞增殖和克隆形成CCK8結(jié)果顯示W(wǎng)M130(0、2、10、20μmol/L)能濃度依賴性地抑制肝癌細(xì)胞Hep3B、MHCC-LM3和MHCC-97H增殖,IC50值分別是8.2、10.6和12.5μmol/L。WM130還能時(shí)間依賴性地抑制肝癌細(xì)胞增殖(0、24、48、72、96h)。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Hep3B、MHCC-LM3和MHCC-97H經(jīng)WM130(0、2、10、20μmol/L)長(zhǎng)時(shí)間(17-21天)處理后,克隆數(shù)顯著減少。二、苦參堿衍生物WM130對(duì)肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的抑制作用(一)WM130對(duì)多柔比星耐藥的肝癌細(xì)胞的影響單藥耐藥實(shí)驗(yàn)顯示DOX對(duì)Hep3B-DOXR和LM3-DOXR細(xì)胞增殖無(wú)抑制作用,而WM130依然能濃度依賴性地抑制Hep3B-DOXR和LM3-DOXR細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果發(fā)現(xiàn),Hep3B-DOXR和LM3-DOXR細(xì)胞中Ep CAM陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與對(duì)照細(xì)胞(未加DOX預(yù)處理)相比分別增加約9倍和20倍。10μmol/L WM130可明顯減少耐藥的肝癌細(xì)胞Ep CAM陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)。(二)WM130對(duì)肝癌干細(xì)胞和肝細(xì)胞功能相關(guān)基因表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示,WM130能濃度依賴地降低Hep3B、MHCC-LM3和MHCC-97H中肝癌干細(xì)胞相關(guān)基因(Ep CAM、CD133、CD90)、人胚胎和全能干細(xì)胞相關(guān)基因(Oct3/4、Sox2、NANOG)以及肝惡性基因(AFP)的表達(dá)水平,而增加正常肝細(xì)胞功能相關(guān)基因(CYP1A3、G-6-P、ALB、ALDOB)的表達(dá)水平,其中膽綠素合成酶(BR)的表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生明顯變化。提示W(wǎng)M130能促進(jìn)肝癌干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化。(三)WM130對(duì)肝癌細(xì)胞成球能力的影響流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示,Hep3B和MHCC-97H球體細(xì)胞含有Ep CAM和CD133雙陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)高達(dá)95%以上,MHCC-LM3球體細(xì)胞含有Ep CAM和CD133陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)分別為65%和43%。WM130能濃度依賴性地減少三種球體細(xì)胞中Ep CAM陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),但對(duì)CD133陽(yáng)性細(xì)胞無(wú)影響。WM130還能顯著減少第一代球體細(xì)胞的數(shù)量并減小其體積;將第一代球體細(xì)胞在沒(méi)有WM130處理的情況下連續(xù)培養(yǎng)兩代,第二、三代球體細(xì)胞的數(shù)量依然減少,表明WM130能抑制CSC的自我更新能力。我們還比較了WM130處理的Hep3B球體細(xì)胞和無(wú)藥處理的對(duì)照細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤能力。無(wú)藥處理的對(duì)照細(xì)胞在裸鼠皮下接種2-3周后,就長(zhǎng)出了可觸及的腫瘤(直徑大約1毫米),而WM130處理組細(xì)胞直到4-5周,皮下才長(zhǎng)出腫瘤;接種45天后取出腫瘤,發(fā)現(xiàn)WM130處理組的腫瘤大小明顯小于對(duì)照組的腫瘤。IHC結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,WM130處理組腫瘤組織中Ep CAM的表達(dá)水平減少大約35%(P0.01)。三、苦參堿衍生物WM130優(yōu)先抑制肝癌球體細(xì)胞CCK8結(jié)果發(fā)現(xiàn),WM130(2、10、20μmol/L)對(duì)Hep3B、MHCC-LM3和MHCC-97H三種球體細(xì)胞增殖抑制作用強(qiáng)于對(duì)三種肝癌細(xì)胞的作用。與之相反的是,化療藥物DOX(1、2、5μmol/L)對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B、MHCC-LM3和MHCC-97H增殖有更強(qiáng)的抑制作用。平板克隆實(shí)驗(yàn)也有相似的結(jié)果。RT-PCR結(jié)果顯示,WM130抑制球體細(xì)胞Ep CAM m RNA表達(dá)的作用更強(qiáng),而對(duì)肝癌細(xì)胞和球體細(xì)胞CD133和Oct3/4 m RNA表達(dá)的抑制作用無(wú)明顯差異。以上結(jié)果表明WM130能優(yōu)先抑制肝癌球體細(xì)胞。四、苦參堿衍生物WM130體內(nèi)對(duì)肝細(xì)胞癌生長(zhǎng)的抑制作用(一)WM130對(duì)肝癌細(xì)胞異種移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用WM130治療組(10mg/kg)異種移植瘤的生長(zhǎng)速度明顯慢于Control組。與WM130或DOX單獨(dú)治療組(3mg/kg)比較,WM130+DOX聯(lián)合用藥組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)速度表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取出腫瘤稱重,腫瘤重量與瘤體生長(zhǎng)大小的趨勢(shì)相一致。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程(21天)中,WM130治療組與對(duì)照組的裸鼠的平均體重相比無(wú)差異,而DOX組裸鼠的體重明顯減輕。WM130與DOX合用也沒(méi)有使裸鼠的體重進(jìn)一步減輕。表明WM130安全性較高,而化療藥物雖然能抑制HCC生長(zhǎng),但同時(shí)也會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性。(二)WM130體內(nèi)對(duì)肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的抑制作用為了進(jìn)一步確證WM130體內(nèi)對(duì)肝癌干細(xì)胞的作用,我們將異種移植瘤取出后,胰蛋白酶消化,獲得的細(xì)胞在無(wú)血清成球細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,WM130治療組瘤塊中球體細(xì)胞數(shù)明顯減少,并且WM130和DOX合用組中球體細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步減少,而DOX治療組瘤塊中球體細(xì)胞的數(shù)目則明顯增加。WM130治療組和與DOX合用組瘤塊中獲取的腫瘤細(xì)胞的克隆形成能力也相較于對(duì)照組明顯減弱。RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)WM130的治療能顯著降低瘤塊中肝癌干細(xì)胞相關(guān)基因Ep CAM的表達(dá)水平,增加肝細(xì)胞功能相關(guān)基因CYP1A3、G-6-P和ALB的表達(dá)水平,而DOX卻增加了肝癌干細(xì)胞相關(guān)基因Ep CAM、CD133和Oct3/4的表達(dá)水平,降低肝細(xì)胞功能相關(guān)基因CYP1A3和G-6-P的表達(dá)水平。DOX治療組瘤塊中獲取的腫瘤細(xì)胞的增殖能力明顯強(qiáng)于對(duì)照組的細(xì)胞。DOX對(duì)DOX治療組的腫瘤細(xì)胞無(wú)抑制作用,而WM130依然能抑制DOX治療組的腫瘤細(xì)胞增殖。五、苦參堿衍生物WM130抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路(一)WM130體外對(duì)Wnt/β-Catenin信號(hào)通路的抑制作用Western blot結(jié)果顯示,WM130能顯著降低Hep3B和MHCC-LM3中GSK3β(Ser9)磷酸化水平,也能抑制β-catenin蛋白及其靶向基因cyclin D1的表達(dá)。(二)WM130體內(nèi)對(duì)Wnt/β-Catenin信號(hào)通路的抑制作用WM130體內(nèi)給藥能降低MHCC-LM3異種移植瘤塊中GSK3β(Ser9)磷酸化水平、β-catenin蛋白及其靶基因Ep CAM蛋白的表達(dá)水平。IHC結(jié)果進(jìn)一步證明WM130體內(nèi)給藥也能抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路,WM130治療組的腫瘤組織中β-catenin和Ep CAM蛋白的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。六、苦參堿衍生物WM130抗肝細(xì)胞癌作用與67LR的關(guān)系研究(一)抗體封閉67LR對(duì)WM130抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用CCK8結(jié)果顯示67LR抗體對(duì)MHCC-LM3和Hep3B增殖無(wú)影響。MHCC-LM3和Hep3B用67LR的同型Ig M抗體預(yù)處理,EGCG和WM130能顯著抑制MHCCLM3和Hep3B的增殖;67LR抗體預(yù)處理MHCC-LM3和Hep3B可使EGCG(40μmol/L)抑制兩種肝癌細(xì)胞增殖的作用分別減弱24%和30%。67LR抗體同樣也能減弱WM130抑制兩種肝癌細(xì)胞增殖作用,WM130(10、20、40μmol/L)抑制MHCC-LM3增殖的作用分別減弱了21%、45%、48%;抑制Hep3B增殖的作用分別減弱了31%、36%、56%。這些結(jié)果說(shuō)明WM130抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用至少部分通過(guò)細(xì)胞膜受體67LR起作用。(二)敲減67LR表達(dá)水平對(duì)WM130抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用1、67LR si RNA(100n M和200n M)降低細(xì)胞67LRm RNA水平可達(dá)50%和75%,細(xì)胞內(nèi)67LR蛋白水平也相應(yīng)地降低。與NC si RNA相比,67LR si RNA能顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖,對(duì)MHCC-LM3和Hep3B細(xì)胞的抑制率分別為25%和59%。結(jié)果顯示,MHCC-LM3和Hep3B轉(zhuǎn)染NC si RNA情況下,WM130(10、20、40μmol/L)能顯著抑制細(xì)胞增殖,但是細(xì)胞轉(zhuǎn)染67LR si RNA后,WM130抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用完全消失。2、穩(wěn)定感染Lenti-NC sh RNA和Lenti-67LR sh RNA的Hep3B細(xì)胞中,WM130(10、20、40μmol/L)能濃度依賴地抑制穩(wěn)定感染對(duì)照病毒Lenti-NC sh RNA的Hep3B細(xì)胞增殖,但對(duì)穩(wěn)定感染Lenti-67LR sh RNA的Hep3B細(xì)胞增殖的抑制作用消失。(三)EGCG減弱WM130抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用EGCG(20μmol/L)與WM130(0、10、20、40μmol/L)共同處理細(xì)胞后,EGCG能使低濃度WM130(10μmol/L)抑制MHCC-LM3和Hep3B增殖的作用減弱,但是不改變高濃度WM130(20和40μmol/L)的作用。以上結(jié)果提示,EGCG與低濃度的WM130競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合67LR,減弱WM130抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用。高濃度WM130的作用可能與67LR無(wú)關(guān),而可能與其促細(xì)胞凋亡有關(guān)。(四)磷酸二酯酶5抑制劑對(duì)WM130抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用EGCG(20μmol/L)顯著增強(qiáng)了西地那非(20μmol/L)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用,這與文獻(xiàn)中報(bào)道的結(jié)果一致。但西地那非并不增強(qiáng)WM130抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用。以上結(jié)果說(shuō)明此通路并不是WM130的作用機(jī)制。(五)蛋白磷酸酶2A抑制劑對(duì)WM130抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用1、5n M和10n M OA對(duì)MHCC-LM3和Hep3B無(wú)生長(zhǎng)抑制作用,20-100 n M能濃度依賴性地抑制兩個(gè)肝癌細(xì)胞的增殖。并且OA(5~40 n M)預(yù)處理顯著減弱WM130和EGCG抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用2、10n M OA可使WM130(10、20、40μmol/L)和EGCG(40μmol/L)抑制MHCC-LM3增殖的作用分別減弱了26%、42%、15%和15%;同樣地,OA預(yù)處理也使WM130(10、20、40μmol/L)和EGCG(40μmol/L)抑制Hep3B增殖的作用分別減弱了25%、44%、22%和15%。這些結(jié)果提示W(wǎng)M130抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用是部分通過(guò)67LR依賴的激活PP2A通路發(fā)揮作用的�！窘Y(jié)論】1、苦參堿衍生物WM130抑制肝癌細(xì)胞增殖和克隆形成。2、苦參堿衍生物WM130優(yōu)先抑制肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞。3、苦參堿衍生物WM130體內(nèi)抑制肝細(xì)胞癌生長(zhǎng)并減少肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞。4、苦參堿衍生物抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路。5、苦參堿衍生物WM130部分通過(guò)67LR抑制肝癌細(xì)胞增殖。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉梅,劉雪英,程建峰;苦參堿的藥理研究進(jìn)展[J];中國(guó)中藥雜志;2003年09期

2 張俊平 ,張珉,周儉平,劉福堂,周斌,謝渭芬,郭澄,張純,錢定華;苦參堿體內(nèi)外抗大鼠肝纖維化的作用(英文)[J];Acta Pharmacologica Sinica;2001年02期

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本文編號(hào)：1708625