本文選題：胰腺癌　切入點(diǎn)：Insulin/IGF-1　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：背景:胰腺癌是目前公認(rèn)的惡性度極高的消化系統(tǒng)腫瘤,也是當(dāng)前研究的主要社會(huì)健康問(wèn)題之一。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,相關(guān)信號(hào)通路上游因子通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)刺激下游底物,影響組織細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡和遷移等,發(fā)揮生物學(xué)作用。G蛋白偶聯(lián)受體和胰島素受體是已知的兩大細(xì)胞膜受體,介導(dǎo)胞外信號(hào)向胞內(nèi)的傳遞。有研究證實(shí)胰腺癌細(xì)胞株內(nèi)存在大量變異G蛋白偶聯(lián)受體及其激動(dòng)劑,相關(guān)信號(hào)系統(tǒng)與胰島素生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路協(xié)同在有絲分裂過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。YAP是Hippo信號(hào)通路下游主要轉(zhuǎn)錄因子和特定環(huán)境下的致癌基因,對(duì)GPCR和Insulin/IGF-1刺激相對(duì)較為敏感。目前已逐漸認(rèn)識(shí)到在胰腺腫瘤組織中存在YAP和TAZ的過(guò)表達(dá)狀態(tài),但GPCR和Insulin/IGF-1信號(hào)串話對(duì)胰腺癌中YAP的調(diào)控尚無(wú)報(bào)道。目的:1、明確GPCR和Insulin/IGF-1串話對(duì)胰腺癌細(xì)胞株內(nèi)YAP核質(zhì)移位、磷酸化和轉(zhuǎn)錄活性的影響;2、探索PI3K/Akt/mTOR在GPCR和Insulin/IGF-1細(xì)胞信號(hào)通路串話中對(duì)胰腺癌細(xì)胞內(nèi)YAP的調(diào)控作用;3、研究PKD在GPCR和Insulin/IGF-1通路系統(tǒng)對(duì)胰腺癌細(xì)胞株內(nèi)YAP活性的影響;4、明確他汀類藥物在胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖中的影響及對(duì)YAP的調(diào)控。方法:1、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)正常生長(zhǎng)和經(jīng)GPCR及Insulin/IGF-1激動(dòng)劑處理的Panc-1、MiaPaCa-2胰腺癌細(xì)胞株內(nèi)YAP核質(zhì)定向遷移情況;Western Blot監(jiān)測(cè)處理前后YAP Ser127磷酸化水平;qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)激動(dòng)劑處理前后YAP-TEAD下游轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子mRNA的水平表達(dá);使用激動(dòng)劑處理YAP和TAZ特異性siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,觀察YAP下游相關(guān)因子表達(dá)、蛋白磷酸化水平,[3H]-Thymidine Incorporation檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA合成情況等;克隆形成、細(xì)胞增殖計(jì)數(shù)觀察激動(dòng)劑處理YAP和TAZ特異性siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)天后的生長(zhǎng)增殖情況。2、應(yīng)用PI3K和mTOR抑制劑A66(梯度濃度)和KU63794干預(yù)細(xì)胞,qRT-PCR檢測(cè)激動(dòng)劑處理與未處理的細(xì)胞下游相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平,Western Blot監(jiān)測(cè)處理前后pAktThr308和p70S6KThr389磷酸化水平;向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染GFP標(biāo)記的AKT-PH質(zhì)粒,應(yīng)用梯度濃度的A66預(yù)處理細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察處理組和對(duì)照組在GPCR和Insulin/IGF-1激動(dòng)劑neurotensin和insulin刺激下PIP3的細(xì)胞膜敏感性和AKT-PH的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。3、應(yīng)用PKD抑制劑CRT0066101(梯度濃度)和kb142-70干預(yù)細(xì)胞,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)激動(dòng)劑處理與未處理的細(xì)胞YAP下游相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平,Western Blot免疫蛋白印跡法檢測(cè)PKD pSer916磷酸化水平;實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)應(yīng)用激動(dòng)劑處理的PKD1、PKD2和PKD3特異性siRNA轉(zhuǎn)染的胰腺癌細(xì)胞下游相關(guān)靶基因表達(dá),免疫蛋白印跡法進(jìn)一步觀察蛋白的磷酸化水平。4、細(xì)胞增殖計(jì)數(shù)和細(xì)胞的克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)他汀類藥物在胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖過(guò)程中的影響;qRT-PCR檢測(cè)在他汀類藥物處理前后的胰腺癌細(xì)胞YAP-TEAD下游相關(guān)靶基因的表達(dá)水平。結(jié)果:1、免疫熒光法觀察密集生長(zhǎng)的胰腺癌細(xì)胞株使用GPCR和Insulin/IGF1激動(dòng)劑neurotensin和insulin刺激30min/60min后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的YAP有向細(xì)胞核內(nèi)遷移的趨勢(shì);免疫蛋白印跡法監(jiān)測(cè)到激動(dòng)劑聯(lián)合刺激后YAP Ser127明顯脫磷酸化;激動(dòng)劑處理后的細(xì)胞YAP/TEAD下游CTGF、Cyr61和CXCL5等相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平升高;通過(guò)轉(zhuǎn)染YAP和TAZ特異性siRNA下調(diào)YAP和TAZ水平能顯著降低激動(dòng)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)YAP/TEAD下游CTGF、Cyr61和CXCL5等相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平、YAP磷酸化水平、DNA的合成、細(xì)胞生長(zhǎng)增殖數(shù)量和克隆數(shù)目。2、梯度濃度的PI3K抑制劑A66能不同程度抑制激動(dòng)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞pAktThr308磷酸化水平;GPCR和Insulin/IGF1激動(dòng)劑neurotensin和insulin處理AKT-PH-GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞后,PIP3在細(xì)胞膜聚集明顯,濃度梯度的A66可不同程度地抑制PI3K介導(dǎo)的PIP3細(xì)胞膜敏感性;不同劑量的A66不同程度影響激動(dòng)劑處理的細(xì)胞YAP下游靶基因mRNA水平表達(dá),mTOR抑制劑KU則在處理前后無(wú)明顯差異。3、PKD抑制劑CRT0066101和kb142-70能抑制激動(dòng)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞YAP/TEAD下游相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平和PKD pSer916磷酸化水平,且磷酸化水平與CRT0066101呈劑量依賴性;通過(guò)轉(zhuǎn)染PKD1、PKD2和PKD3特異性siRNA下調(diào)PKD水平對(duì)YAP下游靶基因mRNA水平和PKD磷酸化存在影響。4、他汀類藥物明顯抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖,抑制經(jīng)過(guò)激動(dòng)劑誘導(dǎo)處理的細(xì)胞YAP下游靶基因mRNA水平下降,他汀類藥物處理后在PKD pSer916磷酸化水平表達(dá)存在存在劑量的依賴性。結(jié)論:1、GPCR和Insulin/IGF-1串話對(duì)胰腺癌細(xì)胞YAP核質(zhì)移位、磷酸化水平和轉(zhuǎn)錄活性存在關(guān)鍵作用,而特異性的敲除YAP可有效抑制胰腺腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖,可能成為未來(lái)腫瘤治療的新靶點(diǎn)。2、GPCR和Insulin/IGF-1通路串話系統(tǒng)通過(guò)PI3K對(duì)下游YAP進(jìn)行調(diào)控,通過(guò)特異性的抑制PI3K可有效降低YAP的相關(guān)生物學(xué)活性,進(jìn)而影響胰腺癌的發(fā)生進(jìn)展相關(guān)過(guò)程。3、特異性的抑制或敲除PKD對(duì)YAP活化存在影響,PKD是GPCR和Insulin/IGF-1通路系統(tǒng)對(duì)YAP調(diào)控的關(guān)鍵上游因子。4、他汀類藥物通過(guò)甲羥戊酸途徑抑制YAP活性,可有效控制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖,具體信號(hào)通路間的相互刺激與抑制有待未來(lái)進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.9

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本文編號(hào)：1706339