本文選題：BRCA2　切入點：Aurora-A激酶　出處：《上海師范大學》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景:乳腺癌在女性中最為常見,且惡性程度極高,易發(fā)生轉移和放化療抵抗。因此,我們迫切的需要發(fā)現(xiàn)并驗證出新型的靶向分子標志物,以更深層的研究乳腺癌的作用機制,以便更好的診斷和治療乳腺癌。乳腺癌易感基因-2(breast cancer type 2 susceptibility protein,BRCA2)是一種抑癌基因�？赏ㄟ^修復DNA損傷、參與有絲分裂和胞質分裂來發(fā)揮抑制腫瘤的功能,但由于BRCA2基因序列太長、蛋白結構相當復雜等原因,導致BRCA2在乳腺癌中的具體作用機理還未有廣泛研究。乳腺癌激活激酶(Breast cancer activated kinase,BTAK/Aurora-A)多被檢測出在腫瘤細胞中有高水平的表達,同時它也參與并調節(jié)DNA損傷、參與有絲分裂、胞質分裂,近年來又有研究表明,Aurora-A參與細胞內分子的轉錄,通過以上行為方式,Aurora-A參與誘導腫瘤的產(chǎn)生。曾有實驗室發(fā)現(xiàn),Aurora-A與BRCA2會相互抑制而關聯(lián)于乳腺癌的發(fā)生、增殖和轉移中�；谝陨蠄蟮�,我們進行了進一步深入的研究。研究目的:經(jīng)大量文獻查閱發(fā)現(xiàn),BRCA2在一些蛋白的誘導下會發(fā)生磷酸化,磷酸化后的BRCA2會發(fā)生結構上的變化,而失去了與一些相關蛋白發(fā)生偶聯(lián)的能力,進而導致其抑制腫瘤的能力也發(fā)生變化。同時Aurora-A激酶會通過誘導抑癌基因P53等翻譯后蛋白的磷酸化來誘導癌癥發(fā)生。上面也提到,Aurora-A與BRCA2通過彼此反向調節(jié)來作用于癌癥。本實驗為了深入研究Aurora-A與BRCA2在腫瘤細胞內的作用機理,推測并逐步驗證二者是否通過磷酸化來相互作用,以及二者磷酸化后是否會調節(jié)細胞的功能甚至機體功能。由于時間有限和嘗試步驟的繁瑣,本論文截至時間實驗只進行到檢測出其磷酸化發(fā)生的大概位置,至于磷酸化發(fā)生的具體氨基酸位點、以及磷酸化過程是否是誘導二者負調控的主要原因還有待進一步的研究。研究方法及結果:本實驗通過原核細胞內的蛋白體外表達技術,成功誘導了BRCA2、Aurora-A、P53蛋白的表達。表達成功后分別構建了Aurora-A與P53(陽性對照)、Aurora-A與BRCA2兩對蛋白質間體外磷酸化反應體系。最后成功在體外構建了各體外純化蛋白、檢測出了適宜的磷酸化反應體系,并最終驗證出BRCA2受Aurora-A在磷酸化體系中誘導后,于其序列靠近C端3064-3208位點之間的蘇氨酸(threonine/thr)上發(fā)生磷酸化。本實驗包括以下四個部分:1.BRCA2的體外分段擴增本實驗首先運用PCR技術、以設計好的兩端帶有Not I和Sal I兩個酶切位點(這兩個酶切位點載體上有而BRCA2片段上沒有)的16對引物將BRCA2以擴增的形式分成大小不等的16段。并將酶切后的16段BRCA2片段分別與酶切后的原核載體PGEX-4T3連接,讓其粘性末端結合,重新交叉重組,構建重組原核質粒。隨后以BL21原核桿菌為基因復制載體,運用轉化等技術手段將16個重組質粒導入原核細胞BL21中,并在適宜條件下培養(yǎng)促進重組質粒在原核細胞中的大量復制。最后用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)在不同條件下誘導蛋白的表達,通過蛋白印跡法(western blot)用GST抗體檢測16個PGEX-4T3-BRCA2-fragment1~16重組質粒在不同條件下表達的蛋白量,并篩選出最優(yōu)條件。通過以上實驗,我們成功誘導表達出16個PGEX-4T3-BRCA2-fragment 1~1重組質粒的蛋白,且為每一個片段找到了能表達最優(yōu)蛋白量的條件。2.Aurora-A激酶誘導P53磷酸化已有研究明確表明,Aurora-A會誘導P53蛋白于絲氨酸(serine/ser)315位點發(fā)生磷酸化,所以我們選擇Aurora-A與P53蛋白的磷酸化反應作為檢測磷酸化體系有效性的陽性對照。本實驗同樣用第一部分中的方法構建了以PGEX-4T3為載體的PGRX-4T3-P53-WT(野生型)和R175H(突變型)兩種原核重組質粒,PGEX-4T1-Aurora-A-WT(野生型)、KDTD(突變型)、T288D(突變型)是實驗室之前已經(jīng)構建好的。隨后也用IPTG以不同條件誘導以上蛋白的體外表達,同樣采用western blot檢測手段用GST抗體驗證蛋白表達是否成功。通過綜合大量的文獻,本實驗選定了一種可行磷酸化反應體系作為擬反應體系,用Aurora-A和P53原核表達蛋白的磷酸化反應對該擬反應體系進行了初步實驗。在該磷酸化體系反應結束后,用SDS樣品緩沖液終止反應,并用phospho-P53(Serine-315)和phospho-Aurora-A(Threonine-288)抗體進行western blot技術檢測。以上結果顯示:首先,該實驗成功篩選出不同片段蛋白表達的最優(yōu)條件,并成功誘導表達了PGEX-4T1-Aurora-A-WT、KDTD、T288D和PGEX-4T3-P53-WT、R175H質粒的蛋白體外表達;其次,通過磷酸化蛋白的驗證,證明該磷酸化體系有效,可用于第三部分Aurora-A對BRCA2的磷酸化誘導。3.Aurora-A激酶誘導PGEX-4T3-BRCA2-fragment 1~16的磷酸化基于以上磷酸化體系誘導磷酸化反應有效,本部分用該磷酸化體系進行Aurora-A誘導16個PGEX-4T3-BRCA2-fragment 1~16蛋白的磷酸化反應。首先將Aurora-A分別與16個PGEX-4T3-BRCA2-fragment 1~16原核重組質粒的表達蛋白在磷酸化體系下磷酸化,并以PGEX-4T3-BRCA2-fragment 1~16相同磷酸化體系但不加Aurora-A作為陰性對照,磷酸化反應結束后同樣用SDS樣品緩沖液終止反應。最后用phospho-serine和phospho-threonine抗體通過western blot技術檢測磷酸化的發(fā)生情況。結果表明,PGEX-4T3-BRCA2-fragment 15在Aurora-A誘導下發(fā)生了磷酸化,且其磷酸化氨基酸位點為蘇氨酸。4.對PGEX-4T3-BRCA2-fragment 15進行再分段并檢測磷酸化水平基于第三部分已經(jīng)確定了磷酸化發(fā)生于2950-3208位點之間,我們對該區(qū)間進行再分段,根據(jù)蛋白結構和AT-GC含量將其分為兩段,并分別與原核載體連接,經(jīng)過上述同樣的方法誘導蛋白的體外表達,以及進行磷酸化,對比兩個片段的磷酸化水平。我們發(fā)現(xiàn),在PGEX-4T3-BRCA2-fragment 15-2上發(fā)生了明顯的磷酸化,由此,我們進一步縮小了磷酸化發(fā)生的范圍為靠近C端3064-3208位點之間。研究結論:實驗表明,在體外的一定條件下,BRCA2的確會在Aurora-A的誘導下發(fā)生磷酸化,且我們驗證出磷酸化發(fā)生的位點為BRCA2蛋白的3064-3208位點之間,即靠近C端的蘇氨酸上。由此,我們可以初步推測,BRCA2在Aurora-A激酶作用下于其近C端發(fā)生磷酸化。BRCA2與RAD 51的結合也是C端,所以該位點的磷酸化是否會影響B(tài)RCA2的功能,比如影響其與RAD 51的聯(lián)合作用,從而影響乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展還有待進一步的研究。
[Abstract]:In order to study the role of Aurora - A and BRCA2 in the pathogenesis of breast cancer , it has been found that Aurora - A and BRCA2 are involved in the genesis , proliferation and metastasis of breast cancer . In this experiment , it has been found that Aurora - A and BRCA2 are involved in the genesis , proliferation and metastasis of breast cancer . In this experiment , we have successfully induced the expression of recombinant plasmid p53protein in prokaryotic cell BL21 . We found that BRCA2 was phosphorylated under the induction of Aurora - A .

【學位授予單位】：上海師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R730.2

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本文編號：1701460