本文選題：NRAGE　切入點(diǎn)：食管癌　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:食管癌是全球威脅人類生命和健康的最常見(jiàn)惡性腫瘤之一,我國(guó)每年食管癌發(fā)病人數(shù)占全球發(fā)病總?cè)藬?shù)的一半以上,以食管鱗癌最為常見(jiàn)。放射治療是食管癌三大治療手段之一,而放射抵抗性是導(dǎo)致其治療失敗的主要原因。我們前期研究發(fā)現(xiàn)NRAGE在放射抗性細(xì)胞株TE13R120中表達(dá)量明顯高于親本TE13細(xì)胞,且NRAGE亞細(xì)胞定位變化可能參與了食管癌細(xì)胞放射抗性的形成。本研究旨在通過(guò)基因轉(zhuǎn)染構(gòu)建NRAGE穩(wěn)定表達(dá)的食管癌細(xì)胞系,采用Real-Time PCR和Western Blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果,并通過(guò)細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)等觀察該基因影響放射抗性的具體機(jī)制,進(jìn)一步明確NRAGE基因與食管鱗癌細(xì)胞放射抗性的關(guān)系,為將來(lái)NRAGE基因在食管癌放射治療中的研究提供細(xì)胞模型及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1采用Real-Time PCR及Western Blot檢測(cè)3種食管癌細(xì)胞系(TE13、Eca109、Kyse170)中NRAGE的m RNA及蛋白表達(dá)情況,選擇NRAGE低表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。2以脂質(zhì)體為載體,將攜有NRAGE基因的真核表達(dá)質(zhì)粒p3XFLAG-CMV-14-NRAGE轉(zhuǎn)染NRAGE低表達(dá)的細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分二組,NRAGE基因轉(zhuǎn)染組(Eca109/NRAGE組)和空白對(duì)照組(Eca109組)。采用G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系(Eca109/NRAGE)。3采用Real-Time PCR及Western Blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組細(xì)胞中NRAGE基因的表達(dá)。4采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)比較轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組細(xì)胞的放射抗性,探討該基因?qū)κ彻荀[癌細(xì)胞放射抗性的影響。5應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞周期變化。6通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組細(xì)胞的凋亡情況。7應(yīng)用Real-Time PCR及Western Blot驗(yàn)證兩組細(xì)胞中β-catenin基因的表達(dá)。結(jié)果:1 Real-Time PCR及Western Blot結(jié)果顯示NRAGE的m RNA及蛋白表達(dá)水平在Eca109細(xì)胞中最低,因此選擇Eca109細(xì)胞進(jìn)行以下試驗(yàn)。2 Real-Time PCR及Western Blot結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)染組NRAGE的m RNA及蛋白表達(dá)均高于空白對(duì)照組(P=0.000),證明外源性NRAGE基因已整合于細(xì)胞基因組中,并獲得穩(wěn)定表達(dá)。3平板克隆形成實(shí)驗(yàn)證明Eca109與Eca109/NRAGE組細(xì)胞的放射敏感性不同,(D0值分別為1.54和1.76Gy,Dq值分別為1.29和1.41Gy,SF2值分別為0.44和0.51,N值分別為1.838和1.802)。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的D0、Dq值均增大,且SF2值是是空白對(duì)照組細(xì)胞的1.159倍,細(xì)胞存活曲線肩區(qū)增寬,這均提示NRAGE轉(zhuǎn)染組細(xì)胞比空白對(duì)照組更具有放射抗性。4流式細(xì)胞技術(shù)分析顯示,與對(duì)照組細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中對(duì)射線抵抗性最強(qiáng)的S期細(xì)胞比例增加,而對(duì)射線最敏感的G2/M期減少。5細(xì)胞凋亡檢測(cè)表明,Eca109/NRAGE組細(xì)胞凋亡率較Eca109組細(xì)胞降低(P=0.0029)。6 Real-Time PCR及Western Blot結(jié)果顯示β-catenin的m RNA及蛋白表達(dá)在Eca109/NRAGE組細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于Eca109組細(xì)胞(P=0.000)。結(jié)論:1通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo),可以建立NRAGE基因穩(wěn)定表達(dá)的食管癌細(xì)胞系。2 NRAGE參與了Eca109/NRAGE組細(xì)胞放射抗性的形成。3 NRAGE改變了Eca109/NRAGE組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布和凋亡,并可能影響食管癌細(xì)胞放射敏感性。4 NRAGE可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與放射抗性的形成。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1700025