本文選題：DAN正四面體　切入點(diǎn)：手性組裝　出處：《東南大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：早期診斷和早期治療是改善癌癥患者的預(yù)后及降低其死亡率的關(guān)鍵所在。腫瘤標(biāo)志物在其中發(fā)揮著重要作用。除了傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物,近年來許多新的且有效的生物分子標(biāo)志物也相繼被學(xué)者發(fā)現(xiàn),其中包括基因甲基化、多種基因突變、端粒酶、血中循環(huán)DNA及microRNA。眾多研究表明,以上幾種生物分子標(biāo)志物對(duì)癌癥早期診斷及預(yù)測的敏感性,特異性均不低于傳統(tǒng)標(biāo)志物。因此,上述幾種標(biāo)志物極可能被廣泛用于臨床上對(duì)癌癥的早期診斷、判斷預(yù)后、和評(píng)價(jià)治療效果。針對(duì)這一研究目的,本論文旨在研究DNA與貴金屬納米粒子,熒光、電化學(xué)活性物質(zhì)等信號(hào)分子及生物大分子的組裝方法,利用其對(duì)信號(hào)分子的高負(fù)載量以及可以在其不同位點(diǎn)同時(shí)精確組裝幾種不同生物分子的特性,設(shè)計(jì)合成了多種DNA納米生物探針,構(gòu)建生物分子標(biāo)志物高靈敏、多組分同時(shí)檢測的新方法。本論文的主要內(nèi)容如下:1.金納米粒子手性二聚體用于檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性及其抑制劑利用DNA誘導(dǎo)金納米粒子進(jìn)行手性組裝和限制性內(nèi)切酶HpaⅡ檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性及其抑制劑。首先,研究粒子尺寸和粒子間距對(duì)手性金納米粒子二聚體手性信號(hào)的影響,篩選出手性信號(hào)最強(qiáng)的金納米粒子二聚體作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的檢測探針。然后利用限制性內(nèi)切酶HpaⅡ可以識(shí)別并切斷二聚體之間的5'-CCGG-3'核酸序列,從而破壞二聚體結(jié)構(gòu),手性信號(hào)減弱。如果有甲基轉(zhuǎn)移酶M.SssI存在時(shí),5'-CCGG-3' DNA序列被甲基化為5'-CCmGG-3',限制性內(nèi)切酶HpaⅡ無法切斷此甲基化序列,因而完整的金納米粒子二聚體依然保持很強(qiáng)的手性信號(hào)。該方法具有寬的線性范圍(0.5 U mL-1到150 U mL-1)、低的檢測限(0.27 U mL-1)、高的選擇性及良好的穩(wěn)定性。同時(shí),我們也用此方法評(píng)估了 5-氮雜胞嘧啶核苷和普魯卡因?qū)谆D(zhuǎn)移酶的抑制效果。總的來說,此方法具有較好的準(zhǔn)確度,特異性,靈敏度,可以檢測血清樣本,有益于臨床診斷和藥物開發(fā)。2.金納米粒子手性二聚體用于檢測8-羥基脫氧鳥苷以8-羥基脫氧鳥苷的核酸適體組裝的金納米粒子手性二聚體為信號(hào)探針,檢測DNA氧化應(yīng)激損傷的標(biāo)志物:8-羥基脫氧鳥苷。首先利用8-羥基脫氧鳥苷的核酸適體組裝金納米粒子二聚體。透射電鏡TEM可以觀察到金納米粒子二聚體的生成,CD光譜儀可以檢測到此二聚體具有很強(qiáng)的手性信號(hào)。當(dāng)溶液中含有檢測物8-羥基脫氧鳥苷時(shí),檢測物會(huì)與其核酸適體結(jié)合,從而破壞二聚體結(jié)構(gòu),手性信號(hào)減弱。通過此方法我們可以定量檢測0.05nM到2nM的8-羥基脫氧鳥苷,最低檢測線為33 pM (信噪比為3)。同時(shí),此方法可用于評(píng)估人血清樣本中8-羥基脫氧鳥苷的含量。總的來說,此方法具有較好的準(zhǔn)確度,特異性,靈敏度,可以檢測血清樣本,有益于臨床診斷。3. DNA正四面體探針用于端粒酶活性的電化學(xué)檢測以DNA正四面體納米材料為基礎(chǔ),研究其在電化學(xué)檢測腫瘤標(biāo)志物端粒酶中的應(yīng)用。在DNA正四面體的一個(gè)頂點(diǎn)引出端粒擴(kuò)增引物,其他三個(gè)頂點(diǎn)修飾巰基,通過金硫鍵將此探針共價(jià)修飾到金電極表面。當(dāng)端粒酶存在時(shí),端粒酶特異性識(shí)別端粒引物,并在其3'末端擴(kuò)增出(TTAGGG)x富G序列。該富G序列在鉀離子和氯化血紅素的作用下形成G-四鏈體,是一種具有類似辣根過氧化物酶催化性質(zhì)的DNA模擬酶。該DNA模擬酶在過氧化氫的存在下催化苯胺聚合成具有電化學(xué)活性的聚苯胺。我們利用示差脈沖伏安法檢測聚苯胺的電化學(xué)信號(hào)從而檢測端粒酶活性。通過調(diào)節(jié)DNA正四面體探針的尺寸,可以控制相鄰端粒引物的距離。當(dāng)此距離接近端粒酶的尺寸時(shí),端粒酶識(shí)別端粒引物并進(jìn)行擴(kuò)增的效率大大增強(qiáng),從而我們可以得到最佳的電化學(xué)輸出信號(hào),顯著提高檢測靈敏度。利用此方法,可以評(píng)估MCF-7,A549, MDA-MB-231,HeLa等細(xì)胞中的端粒酶活性。該方法的最低檢測限為1個(gè)細(xì)胞/10微升,檢測范圍為5到5000個(gè)細(xì)胞,與單鏈端粒引物探針相比,信號(hào)提高20倍。該方法用于檢測膀胱癌患者尿樣中脫落細(xì)胞的端粒酶活性時(shí),得到的結(jié)果與臨床病理檢測結(jié)果一致。4.基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)同時(shí)檢測三種與肺癌相關(guān)microRNA設(shè)計(jì)三種不同熒光素(Cy3, Cy3.5, Cy5)標(biāo)記的核酸探針,對(duì)應(yīng)識(shí)別三種microRNA(miRNA-155, miRNA-182, miRNA-197),形成雙螺旋核酸探針。核酸染料TOTO-1可以嵌入到核酸探針骨架中,通過單波長激發(fā),將熒光共振能量轉(zhuǎn)移給相應(yīng)的熒光素,產(chǎn)生不同的熒光信號(hào),實(shí)現(xiàn)多組分檢測腫瘤標(biāo)志物microRNA。顯著提高相關(guān)腫瘤診斷的準(zhǔn)確度。核酸染料TOTO-1本身在溶液中幾乎不發(fā)出熒光信號(hào),但當(dāng)它嵌入到雙鏈核酸骨架中時(shí),其熒光信號(hào)顯著提高約1000倍。其發(fā)射光譜與Cy3, Cy3.5, Cy5的激發(fā)光譜重疊,可以產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)。miRNA-155, miRNA-182, miRNA-197作為肺癌發(fā)病早期的標(biāo)志物,在血漿中同時(shí)診斷出三種microRNA的存在,可以顯著提高疾病診斷的準(zhǔn)確度,為臨床上疾病的早期診斷提供有效途徑。因此多組分檢測腫瘤標(biāo)志物microRNA在生物醫(yī)學(xué)和臨床中具有廣闊的應(yīng)用前景。5.金納米粒子比色法檢測甲型流感病毒H3N2金納米粒子表面功能化修飾抗血凝素單克隆抗體(mAb),得到mAb-AuNPs探針。mAb-AuNPs探針通過抗血凝素單克隆抗體特異性識(shí)別甲型流感病毒囊膜表面富含的血凝素,從而得到探針/病毒組裝體。該探針/病毒組裝體上的金納米粒子相鄰很近,容易產(chǎn)生等離子共振耦合(SPR)效應(yīng),在紫外可見光譜上表現(xiàn)為金納米粒子的最大吸收峰發(fā)生紅移,裸眼可見組裝體的溶液由紅色變?yōu)樗{(lán)色。同時(shí),利用透射電子顯微鏡(TEM)技術(shù)和動(dòng)態(tài)光散射(DLS)技術(shù)對(duì)探針/病毒組裝體進(jìn)行表征。在最佳檢測條件下,我們利用此方法可以最低檢測出7.8 HAU的甲型流感病毒H3N2IAV (A/Brisbane/10/2007)。此方法展現(xiàn)出高特異性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性。重要的是,此方法利用功能化金納米粒子可以一步法檢測流感病毒,紫外光譜讀出信號(hào),不需要進(jìn)行信號(hào)放大。同時(shí),此方法可以擴(kuò)展應(yīng)用到其他病原體的可視化檢測。
[Abstract]:In addition to the traditional tumor markers , many new and effective biomarkers have been found to be used in the early diagnosis of cancer , to judge the prognosis and to evaluate the therapeutic effect . In general , the method has better accuracy , specificity and sensitivity , and can detect the content of 8 - hydroxydeoxyguanosine in human serum sample . The invention relates to a method for detecting telomerase activity in MCF - 7 , A549 , MDA - MB - 231 , HeLa cells . At the same time , the probe / viral assembly was characterized by means of transmission electron microscopy ( TEM ) and dynamic light scattering ( dls ) . Under optimal detection conditions , we can detect the influenza A virus of 7.8 HAU by using this method . This method exhibits high specificity , accuracy and stability . It is important to use functionalized gold nanoparticles to detect influenza virus and ultraviolet spectrum read signal one step .

【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R730.4;O652

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1686506