本文選題：TNFAIP8　切入點(diǎn)：胃癌　出處：《山東大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：研究背景和意義：胃癌(Gastric cancer,GC)作為嚴(yán)重威脅人類健康的消化系統(tǒng)惡性疾病之一,盡管在過去的幾年里其發(fā)病率有所減少,但其死亡率仍然在各大惡性腫瘤中高居第二位,在新發(fā)的病例中居第四位�，F(xiàn)有的治療手段中,手術(shù)切除和輔助化療雖然取得了巨大的進(jìn)步,甚至有些胃癌在早期是可以被治愈的。然而不幸的是多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于晚期,原本有效的治療方法變得效果不佳或無效。因此,迫切需要探索一種有效的腫瘤標(biāo)志物用于早期診斷及改進(jìn)治療策略。最近,一種新的候選癌基因-腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8(Tumor necrosis factor-a-induced protein 8, TNFAIP8),逐漸引起了學(xué)者們的關(guān)注。TNFAIP8也被稱做GG2-1,SCC-S2,MDC-3.13。該基因在染色體上位于5q23.1并且存在于多數(shù)的惡性腫瘤組織中。近年來TNFAIP8在腫瘤形成中的一系列作用在不斷被證實(shí),這些結(jié)果表明,TNFAIP8在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,參與到腫瘤細(xì)胞的增殖,侵襲、遷移、凋亡和耐藥性的眾多過程。有研究表明TNFAIP8在肺癌,乳腺癌,胰腺癌,結(jié)腸癌等惡性腫瘤中均存在高表達(dá),并與腫瘤的臨床病理特征和預(yù)后有一定相關(guān)性,但其在胃癌中的表達(dá)和參與調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞生長,侵襲及遷移機(jī)制尚未確定。如果能明確其調(diào)節(jié)機(jī)制并找到相應(yīng)的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行干預(yù),或許對(duì)于胃癌的治療,預(yù)后的改善有著非常重要的臨床意義和應(yīng)用前景。第一部分TNFAIP8在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況研究目的：明確TNFAIP8在胃癌組織和細(xì)胞中的是否存在表達(dá),以及其表達(dá)情況與臨床病理特征和不良預(yù)后的關(guān)系。材料：1.收集新鮮的胃癌組織和臨近正常組織標(biāo)本(4對(duì))通過Western blot檢測(cè)TNFAIP8相關(guān)蛋白表達(dá)水平。2.收集2007年1月1日至2008年7月1日期間山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院收治86例胃癌確診患者的胃癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本。所有入組患者遵循NCCN指南的治療標(biāo)準(zhǔn),均接受了根治性手術(shù)切除,所有患者在手術(shù)前未曾接受包括放療或化療在內(nèi)的任何治療。所有從患者和健康對(duì)照組獲取的標(biāo)本均取得受試者的知情同意和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者術(shù)后病理均證實(shí)胃癌診斷。3.我們中心實(shí)驗(yàn)室保存有GES-1,MKN-28, SGC-7901,MGC-803細(xì)胞。人胃癌腫瘤細(xì)胞系NCI-N87由上海交大附屬瑞金醫(yī)院消化外科研究所提供。研究方法：用免疫熒光方法進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)定位,再使用免疫組織化學(xué)染色和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)來評(píng)估TNFAIP8在胃癌組織和細(xì)胞及其癌旁的正常組織和細(xì)胞中的表達(dá),并通過對(duì)86名胃癌患者的長期隨訪進(jìn)一步分析TNFAIP8與臨床病理特征的關(guān)系及其預(yù)后的作用。1.組織標(biāo)本的免疫組化染色和免疫熒光法從山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院病理科調(diào)取所需的腫瘤組織進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋,然后制成厚度為4μm的切片。隨后組織切片依照SABC制造商的操作說明進(jìn)行脫蠟。用0.3%的過氧化氫和阻斷血清來阻斷非特異性的內(nèi)生性抗原。隨后切片用PBS夜沖洗3遍,每遍5分鐘。然后加入TNFAIP8兔多克隆抗體(1：100稀釋),在4℃溫度下孵育過夜。然后將組織切片再次經(jīng)PBS液沖洗后,加入二抗,在37℃溫度下繼續(xù)孵育30分鐘,然后組織切片加入DAB顯色試劑盒和蘇木素染色。以上實(shí)驗(yàn)步驟重復(fù)三遍,在此過程中同時(shí)應(yīng)用免疫熒光技術(shù)來進(jìn)行TNFAIP8蛋白在細(xì)胞中的定位。2.免疫組織化學(xué)染色法評(píng)價(jià)免疫組化染色后的組織切片由兩名病理學(xué)專家進(jìn)行評(píng)價(jià),他們事先并不知道患者確切條件。其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)基于染色的強(qiáng)度及TNFAIP8表達(dá)的染色比例。對(duì)于染色強(qiáng)度來說其程度評(píng)分分類如下：0分(陰性),1分(弱),2分(中度),3分(強(qiáng))。對(duì)于TNFAIP8表達(dá)染色的比例進(jìn)行評(píng)分標(biāo)度如下：0分(無表達(dá)),1分(表達(dá)25%),2分(表達(dá)26%-50%),3分(表達(dá)51%-75%),和4分(表達(dá)75%)。最后的結(jié)果是強(qiáng)度和比例分?jǐn)?shù)的疊加。少于4分的被認(rèn)為是低表達(dá),4分以上的被認(rèn)為是高表達(dá)。3.細(xì)胞培養(yǎng)我們中心實(shí)驗(yàn)室保存有GES-1, MKN-28, SGC-7901, MGC-803細(xì)胞。人胃癌腫瘤細(xì)胞系NCI-N87由上海交大附屬瑞金醫(yī)院消化外科研究所提供。細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),同時(shí)放入10%滅活胎牛血清,青霉素(100U/L),鏈霉素(100mg/L)。培養(yǎng)環(huán)境為5% CO2潮濕環(huán)境,環(huán)境溫度維持37℃。4.定量RT-PCR (qPCR)根據(jù)產(chǎn)品供應(yīng)商(nvitrogen, Carlsbad, CA)的說明,采用TRIzol從細(xì)胞中提取出總RNA,將提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,所得的cDNA用基因特異性引物(大連1aKaRa公司)通過實(shí)時(shí)定量PCR (The LightCycler 480 Real-Time PCR System, Roche, China)進(jìn)行擴(kuò)增。引物對(duì)的序列如下：TNFAIP8上游引物：5'-TTCCATCAGGTGGATTATACCTTTG-3';下游引物：5'-AGGTGGCGCTGAATGATTTG-3'。mRNA水平以GAPDH為內(nèi)參。5. Western蛋白印跡分析簡(jiǎn)言之,組織和細(xì)胞經(jīng)過洗滌,溶胞和收獲。使用bicinchoninic acid protein assay Kit(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)所得到的溶胞產(chǎn)物的蛋白濃度進(jìn)行評(píng)價(jià)。適當(dāng)量的蛋白質(zhì)通過12%Tris-glycine聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。纖維素膜封閉后加入TNFAIP8抗體,為兔抗人(1：500稀釋,購置Abcam64988,USA),在4℃溫度下孵育過夜。第二天,用TBST洗膜3次,每次10分鐘。再放入相應(yīng)的二抗孵育1小時(shí)。再次洗滌3次,每次10分鐘后,用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(ECL,購自Pierce Biotechnology Inc.,Rockford, IL, USA)來檢測(cè)結(jié)合二抗。蛋白水平的檢測(cè)以β-actin為內(nèi)參。6.統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS18.0軟件(SPSS inc. USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。TNFAIP8在人胃癌細(xì)胞系和組織中的蛋白和mRNA表達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn),高倍鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示�？ǚ綑z驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)用于分類變量。P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果：1.組織標(biāo)本的免疫組化染色和免疫熒光法顯示TNFAIP8在胃癌組織中及胃癌細(xì)胞系中存在表達(dá),且表達(dá)定位于胞漿。2.在86例胃癌組織中有65例表達(dá)TNFAIP8,陽性率75.58%,86例癌旁組織中22例表達(dá)TNFAIP8,陽性率25.58%,p0.05。說明TNFAIP8在胃癌組織中表達(dá)高于正常組織,且免疫組化染色評(píng)分顯示,TNFAIP8的表達(dá)和腫瘤浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)(P0.05),進(jìn)一步研究顯示86名患者中(T1和T2期的共30人,T3和T4期共56人),TNFAIP8在T3和T4期腫瘤中表達(dá)明顯高于T1和T2期(p=0.0013),而不同T分期腫瘤相鄰的正常組織中表達(dá)無明顯差異(p=0.6831)。3.應(yīng)用Western蛋白印跡分析,證實(shí)TNFAIP8蛋白在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)高于正常組織和正常胃粘膜細(xì)胞(P0.05, Student's t-test)。結(jié)論：1.TNFAIP8在胃癌組織中及胃癌細(xì)胞系中存在表達(dá),且蛋白表達(dá)定位于胞漿。2.TNFAIP8的表達(dá)與胃癌浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān),研究表明TNFAIP8的表達(dá)上調(diào)和腫瘤臨床病理特征和不良預(yù)后存在顯著的相關(guān)性。3.TNFAIP8蛋白在胃癌組織中的表達(dá)高于正常組織。第二部分TNFAIP8對(duì)調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞生長,影響侵襲及遷移的研究研究目的：通過第一步實(shí)驗(yàn),我們已經(jīng)證實(shí)TNFAIP8在胃癌組織和細(xì)胞中的高表達(dá),然后,我們研究小組將TNFAIP8基因敲除進(jìn)而檢測(cè)其潛在的調(diào)節(jié)機(jī)制以及與增殖,侵襲,遷移的關(guān)系。研究方法：1. 序列設(shè)計(jì)和載體構(gòu)建小干擾RNA的處理:TNFAIP8基因的小干擾RNA由Shanghai Genechem Co. Ltd.合成。siRNA-TNFAIP8(5'-CCACCTTAATAGACGACACAA-3')的DNA序列是根據(jù)人TNFAIP8 cDNA的核心序列設(shè)計(jì)的。那些根據(jù)產(chǎn)品供應(yīng)商的操作說明成功的轉(zhuǎn)染小干擾RNA的細(xì)胞將放在顯微鏡下進(jìn)行觀察轉(zhuǎn)染率。2.慢病毒轉(zhuǎn)染在96孔板上將SGC-7901 and MKN-28胃癌細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)至5×103個(gè)細(xì)胞/每孔的濃度后立即以不同感染復(fù)數(shù)的慢病毒載體感染這些細(xì)胞直至它們達(dá)到50-60%的轉(zhuǎn)染率。72小時(shí)后其感染的效果即可在倒置熒光顯微鏡上觀察到。3. Western蛋白印跡分析同第一部分實(shí)驗(yàn)方法。4. 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)將胃癌細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,然后將1x103細(xì)胞置于直徑60毫米內(nèi)含4毫升完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,在37-C的溫度,5%C02環(huán)境中培養(yǎng)10天。計(jì)算隨機(jī)選取的5個(gè)區(qū)視野的細(xì)胞數(shù),以其均值±標(biāo)準(zhǔn)差作為結(jié)果,至少含有50個(gè)細(xì)胞的集落才有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)胃癌細(xì)胞(8×102 cells)在含有100微升10%滅活胎牛血清的96孔培養(yǎng)板中,在37℃的溫度5% CO2環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)24,48,72,96,120小時(shí)。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8) (Dojindo C0038, Japan)來評(píng)估細(xì)胞數(shù)目。簡(jiǎn)而言之,將10μl的CCK-8加入到每個(gè)孔中,培養(yǎng)1小時(shí)的,檢測(cè)各個(gè)孔在450nm的吸光值來計(jì)算細(xì)胞數(shù)目。每孔獨(dú)立的重復(fù)六次。6. 侵襲和遷移檢測(cè)行侵蝕檢測(cè)時(shí),依照廠家說明使用24孔板系統(tǒng)操作(24-well insert, 8-μm pore size; Corning, NY, USA)。用50毫升含有Matrigd膠平鋪上層小室,再將3x105個(gè)細(xì)胞濃度的培養(yǎng)基200微升置于上層小室。侵襲實(shí)驗(yàn)需要在Transwell小室中鋪入Matrigel膠,而遷移實(shí)驗(yàn)則不需要。最后,在兩者檢測(cè)中將膜切下來用蘇木素染色并拍照。7. 統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)讀取等檢測(cè)步驟重復(fù)進(jìn)行三遍,指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,根據(jù)需要選用配對(duì)資料的t檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,選用雙側(cè)檢驗(yàn)。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果：1.在SGC-7901和MKN-28兩種細(xì)胞系中,用小干擾RNA轉(zhuǎn)染后進(jìn)行TNFAIP8基因沉默,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR和Western蛋白印跡分析證實(shí),與對(duì)照組相比其蛋白表達(dá)和mRNA水平顯著降低(P0.01)。2.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：SGC-7901組集落數(shù)：129.24-18.13；SGC-7901-siRNA組集落數(shù)：62.2±8.68；MKN-28組集落數(shù)：140.0±14.45；MKN-28-siRNA組集落數(shù)：56.8±6.11；p0.05。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果和CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣提示將TNFAIP8基因沉默后其細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制。3.細(xì)胞侵襲和增殖實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染后的SGC-7901和MKN-28細(xì)胞,其繁殖能力,侵襲及遷徙能力顯著下降(P0.05)。結(jié)論：1.TNFAIP8基因沉默后,其蛋白表達(dá)和mRNA水平顯著降低。2.細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)和CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示TNFAIP8基因沉默后,細(xì)胞增殖能力明顯降低。3.侵襲和遷徙實(shí)驗(yàn)顯示TNFAIP8基因沉默后,細(xì)胞侵襲和遷移能力顯著減弱。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 聞強(qiáng);廖洪鋒;袁思波;邱興烽;莊國洪;劉忠臣;;TNFAIP8在胃癌組織中表達(dá)的研究和臨床意義[J];免疫學(xué)雜志;2012年02期

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本文編號(hào)：1684756