本文選題：胃癌　切入點：過表達　出處：《河南大學》2016年碩士論文

【摘要】：背景胃癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一,中、日、韓等亞洲國家是胃癌的高發(fā)區(qū)。據(jù)統(tǒng)計每年我國胃癌的新發(fā)病例約占到世界總發(fā)病例數(shù)的42%,總數(shù)接近40萬例。2011年中國城市居民中胃癌的死亡率為19.66/10萬,而農(nóng)村居民胃癌的死亡率為約為22.09/10萬,位于惡性腫瘤導致死亡的第2位。由于目前胃癌的外科手術治療越來越規(guī)范化、內(nèi)科對于胃癌的藥物治療等綜合治療也得到了進一步的發(fā)展,許多胃癌患者的生存期及生活質(zhì)量都得到了很大的提高,盡管如此,胃癌患者的5年生存率仍低于40%。因此從分子水平來全面理解胃癌發(fā)生進展的機理,并在此基礎上尋求有效的防治方法依然是當前胃癌研究的重點和難點。PTEN基因是一個研究較多的抑癌基因,定位于人染色體l0q23.3,該基因包含有9個外顯子和8個內(nèi)含子,全長約200kb,編碼由403個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)具有磷酸酶活性,它能特異性地使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)去磷酸化,拮抗PI3K/AKT的信號通路,對細胞的生長、增殖、凋亡、存活進行調(diào)控,抑制細胞惡性轉(zhuǎn)化。目前PTEN已經(jīng)被認為癌癥診斷和預后的標志物。micro RNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類小非編碼、內(nèi)源性的短單鏈RNA,大約19-22nt,它可以通過與靶基因m RNA 3'UTR區(qū)發(fā)生互補結合,抑制靶基因功能蛋白質(zhì)的翻譯,在轉(zhuǎn)錄水平對基因的表達進行調(diào)控。已經(jīng)得到證明的有膠質(zhì)瘤、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌等多種腫瘤細胞,在這些研究中mi RNA調(diào)控PTEN基因的表達,抑制PTEN蛋白翻譯,影響腫瘤細胞增殖的作用。PTENP1是PTEN基因的假基因,位于染色體9p13.3。有研究表明PTENP1 3'非編碼區(qū)(3'UTR)與PTEN的3'UTR有近95%的相似區(qū)域,而其中兩基因有相同的mi RNA作用位點。因此,以PTEN為靶基因的mi RNA也會同時作用與PTENP1,與PTEN競爭性的結合mi RNA,使得PTEN的功能性得以保存。本研究克隆出PTEN與PTENP1相同的mi RNA作用片段(本文中用pp表示),構建pc DNA3.1-pp瞬時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,在細胞水平比較轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后的胃癌細胞與未處理和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力的差別,并檢測了過表達pp片段后PTEN的表達情況,為腫瘤的治療提供新的思路。目的構建pc DNA3.1-pp瞬時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入胃癌細胞后觀察對細胞生長、遷移和侵襲能力的影響,研究pp片段對PTEN表達的影響,為進一步的機制研究打下基礎。方法1.采用PCR、膠回收、質(zhì)粒提取的方法獲取目的片段,并將其插入真核表達載體pc DNA3.1內(nèi),構建重組質(zhì)粒pc DNA3.1-pp,通過酶切電泳分析及測序的方法對重組質(zhì)粒進行鑒定。2.應用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒pc DNA3.1-pp及pc DNA3.1空載體轉(zhuǎn)染入BGC823細胞中,然后用Western Blotting的方法從蛋白質(zhì)水平檢測PTEN基因的表達。3.通過細胞計數(shù)、劃痕實驗、細胞侵襲實驗對轉(zhuǎn)染前后細胞的生長、遷移和侵襲能力進行比較觀察、比較和分析。結果1.Western Blotting檢測PTEN基因的蛋白表達結果顯示,重組質(zhì)粒pc DNA3.1-pp轉(zhuǎn)染BGC823細胞株后PTEN的表達明顯高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞及未處理組細胞,而空質(zhì)粒組與未處理組細胞間PTEN的表達量比較無統(tǒng)計學差異。2.2.用自動計數(shù)儀記錄三組細胞每天的細胞數(shù),共記錄7天。用Graph Pad prism處理數(shù)據(jù)可以看出,重組質(zhì)粒pc DNA3.1-pp組的細胞數(shù)明顯低于空質(zhì)粒組及未處理組細胞,差異具有統(tǒng)計學意義,而空質(zhì)粒組與未處理組細胞間細胞數(shù)的差異無統(tǒng)計學意義。3.劃痕實驗檢測細胞的水平遷移能力,重組質(zhì)粒pc DNA3.1-pp組的細胞遷移率明顯低于空質(zhì)粒組及未處理組細胞,差異具有統(tǒng)計學意義,而空質(zhì)粒組與未處理組之間細胞遷移率的差異無統(tǒng)計學意義。4.Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力,與空質(zhì)粒組與未處理組相比較,重組質(zhì)粒pc DNA3.1-pp組穿膜細胞數(shù)顯著增多,差異具有統(tǒng)計學意義,而前兩者之間的穿膜細胞數(shù)的差異無統(tǒng)計學意義。結論成功構建瞬時轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-pp重組質(zhì)粒的BGC823細胞,過表達pp片段可以增加PTEN的表達,胃癌細胞的生長、遷移及侵襲能力下降。
[Abstract]:Background gastric cancer is one of the world's most common malignant tumor of digestive tract in Japan, South Korea and other Asian countries is the high incidence of gastric cancer. According to statistics, every year new cases of gastric cancer in China accounted for about 42% of the world total number of the cases, a total of nearly 400 thousand cases of gastric cancer.2011 China city residents of the annual mortality rate was 19.66/10 million while rural residents, the mortality rate of gastric cancer is about 22.09/10 million, in malignant tumors led to the deaths of second. Due to the surgical treatment of gastric cancer is more and more standardized, medicine for gastric cancer drug therapy combined therapy has also been further developed, many patients with gastric cancer survival and quality of life have been greatly improve, nevertheless, gastric cancer patients 5 years survival rate is less than 40%. from the molecular level to fully understand the mechanism of progression of gastric cancer, and on this basis for effective prevention and treatment is still The focal point of.PTEN gene in gastric cancer research is a study of many tumor suppressor gene, located on human chromosome l0q23.3. This gene contains 9 exons and 8 introns, approximately 200KB in length, encoding a 403 amino acid protein, the protein with phosphatase activity, it can. Specifically the phosphatidylinositol -3,4,5- three phosphate (PIP3) phosphorylation, signal pathway antagonist PI3K/AKT, on cell growth, proliferation, apoptosis, survival regulation, inhibition of cell malignant transformation. At present, PTEN has been considered markers of.Micro RNA cancer diagnosis and prognosis is a kind of non encoding discovered in recent years. A short, single stranded RNA, endogenous about 19-22nt, it can occur through complementary binding with target gene m RNA 3'UTR region, inhibiting target gene function of protein translation at the transcription level of gene expression regulation has been demonstrated. The glioma, ovarian cancer, breast cancer, bladder cancer and other tumor cells, the expression of MI RNA in the study of gene regulation of PTEN, inhibition of PTEN protein translation,.PTENP1 influences the proliferation of tumor cells is a pseudogene PTEN gene, located on chromosome 9p13.3. research showed that PTENP1 3'encoding region (3'UTR) a similar area of nearly 95% PTEN and 3'UTR, and two of the MI gene RNA site in the same. Therefore, based on PTEN mi RNA target genes will also function with PTENP1, and with MI RNA PTEN competition, the function of PTEN can be preserved. This study cloned mi RNA. A fragment of PTEN with the same PTENP1 (the PP), to construct the PC transient transfection of DNA3.1-pp plasmid, in comparison with the transfection of gastric cancer cells and untreated and empty plasmid transfected gastric cancer cell cell proliferation, migration and invasion of the poor Don't, and detected the expression of PTEN PP fragment, to provide new ideas for the treatment of cancer. Objective to construct PC transient transfection of DNA3.1-pp plasmid, the recombinant plasmid was transfected into gastric cancer cells after observation of the effect of cell growth, migration and invasion, the effects of PP on the expression of PTEN fragment, lay the foundation for further studies. 1. methods of using PCR, plastic recycling, methods of Plasmid Extraction to obtain fragments and inserted into the eukaryotic expression vector PC to construct recombinant plasmid DNA3.1, PC DNA3.1-pp, through the method of enzyme digestion analysis and sequencing for identification of.2. recombinant plasmid by liposome on the recombinant plasmid PC DNA3.1-pp the PC and DNA3.1 vector transfected into BGC823 cells, then use Western Blotting to detect the expression of.3. PTEN gene from protein level by cell counting, scratch test, cell invasion assay in turn After dyeing cell growth, migration and invasion were observed, compared and analyzed. The results of detection of PTEN gene 1.Western Blotting protein expression showed that the expression of recombinant plasmid PC DNA3.1-pp in BGC823 cells transfected with PTEN was significantly higher than that of empty plasmid transfected cells and untreated cells, while the expression of empty plasmid group and the untreated group the amount of PTEN cells had no significant difference in.2.2. with automatic counting the number of cells recorded in three groups of cells were recorded every day, for 7 days. Using Graph Pad prism data can be seen, the number of cells of recombinant plasmid PC in DNA3.1-pp group was significantly lower than the empty plasmid group and untreated cells, the difference was statistically significant, while the differences the empty plasmid group and untreated cells between the cell number was not statistically significant.3. scratch assay the level of migration, recombinant plasmid PC group DNA3.1-pp cell migration rate Significantly lower than the empty plasmid group and untreated cells, the difference was statistically significant, while the empty plasmid group and untreated cell migration rate differences between groups was not statistically significant.4.Transwell assay, cell invasion ability, with the empty plasmid group compared with the untreated group, the recombinant plasmid PC DNA3.1-pp cells increased significantly. The difference was statistically significant, there was no significant difference between the former two transmembrane cell number. Conclusion the successful construction of the recombinant plasmid DNA3.1-pp was transfected into PC BGC823 cells, overexpression of PP fragment can increase the expression of PTEN and gastric cancer cell proliferation, migration and invasion ability decreased.

【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2

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