本文選題：前列腺癌　切入點(diǎn)：腫瘤干細(xì)胞　出處：《暨南大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：前列腺癌是一種嚴(yán)重威脅男性健康的惡性腫瘤,目前治療前列腺癌的方法均未能達(dá)到理想的效果,而去勢(shì)抵抗和腫瘤轉(zhuǎn)移更是棘手問(wèn)題,探討前列腺癌的生物學(xué)特性、尋找潛在的治療靶點(diǎn)可能為臨床治療開(kāi)辟新途徑。近年來(lái)研究表明,腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)在惡性腫瘤局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起重要作用。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞的祖細(xì)胞,它們雖占腫瘤中極少部分,但具有類似于成體干細(xì)胞的自我更新能力和多分化潛能,是腫瘤發(fā)生、擴(kuò)散、復(fù)發(fā)等過(guò)程的起始細(xì)胞,對(duì)腫瘤發(fā)生、維持腫瘤內(nèi)穩(wěn)態(tài)并使腫瘤的侵襲性增高進(jìn)而出現(xiàn)轉(zhuǎn)移起決定性的作用。miRNAs(micro RNAs)是一類內(nèi)源性小型非編碼RNA,被稱為微小RNA,由大約22個(gè)核苷酸分子組成,通過(guò)與靶基因mRNA的3'UTR結(jié)合阻斷靶基因mRNA的翻譯,負(fù)性調(diào)控基因的表達(dá)。已被研究證實(shí)它們是在人類癌癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用的調(diào)節(jié)分子。最新證據(jù)表明,miRNAs的異常表達(dá)與大量癌癥疾病中的腫瘤干細(xì)胞失調(diào)有關(guān)。近年來(lái)miR-218的研究成為熱點(diǎn),其與肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤相關(guān),在不同的腫瘤中調(diào)控的靶基因和功能也有不同的變化。RELN(reelin)是一種細(xì)胞外糖蛋白,是一個(gè)由3461個(gè)氨基酸組成對(duì)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,與神經(jīng)元細(xì)胞和幾種類型的非神經(jīng)元細(xì)胞的定位和遷移相關(guān)。最新研究表明,在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中RELN高表達(dá),且RELN高表達(dá)與骨髓瘤細(xì)胞預(yù)后不良有關(guān)。Reelin在細(xì)胞遷移和癌癥轉(zhuǎn)移中的作用在很大程度上尚不清楚,特別是在腫瘤干細(xì)胞(CSCs)中的作用尚不清楚。本課題組先前的研究顯示,miR-218在前列腺癌組織中異常表達(dá)。然而,miR-218確切的作用機(jī)制尚不清楚,是否通過(guò)調(diào)節(jié)CSCs進(jìn)而影響前列腺癌的生物學(xué)行為以及如何調(diào)控CSCs均未闡明。因此,深入探討miR-218異常表達(dá)在前列腺癌干細(xì)胞中的作用,將有助于認(rèn)識(shí)前列腺癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為及其潛在機(jī)制,為前列腺癌的早期診斷及預(yù)后提供新的指標(biāo),同時(shí)也為前列腺癌的治療提供新的治療靶點(diǎn)。在本研究中,我們探討miR-218通過(guò)調(diào)控下游靶基因RELN影響前列腺癌CSCs的干性。目的:(一)通過(guò)探討miR-218在前列腺癌組織和前列腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究其在前列腺癌干細(xì)胞中的功能奠定基礎(chǔ)。(二)探討miR-218在CD44+/CD133+腫瘤干細(xì)胞PC-3CSCs中的作用。(三)研究miR-218和RELN對(duì)前列腺癌干細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響,明確靶基因RELN的功能。方法:(一)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)40例人體前列腺癌組織標(biāo)本及其配對(duì)癌旁組織標(biāo)本中miR-218的表達(dá)。(二)采用免疫磁珠法從無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞中分選CD44+/CD133+前列腺癌干細(xì)胞群和非干細(xì)胞群,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)了兩個(gè)細(xì)胞群中細(xì)胞純度,并通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了兩個(gè)細(xì)胞群中miR-218的表達(dá)。(三)采用miR-218 mimics慢病毒轉(zhuǎn)染前列腺癌干細(xì)胞PC-3 CSCs,qRT-PCR驗(yàn)證miR-218的表達(dá)。(四)通過(guò)MTT檢測(cè)miR-218對(duì)PC-3 CSCs增殖能力的影響;平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-218對(duì)PC-3 CSCs克隆形成能力的影響;腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)?zāi)[瘤干細(xì)胞PC-3 CSCs自我更新能力;Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-218對(duì)PC-3 CSCs細(xì)胞遷移侵襲能力的影響;裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-218對(duì)PC-3 CSCs體內(nèi)成瘤能力的影響。(五)通過(guò)TargetScan、picTar和miRnada靶基因預(yù)測(cè)軟件篩選腫瘤遷移相關(guān)的靶基因;雙熒光素酶基因報(bào)告載體系統(tǒng)間接驗(yàn)證miR-218下游靶基因RELN;Western blot直接驗(yàn)證經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染miR-218 mimics和inhibitor后,細(xì)胞中RELN蛋白表達(dá)水平。(六)轉(zhuǎn)染RELN過(guò)表達(dá)載體到miR-218過(guò)表達(dá)的miR-218 PC-3 CSCs細(xì)胞,通過(guò)MTT檢測(cè)RELN對(duì)miR-218 PC-3 CSCs增殖能力的影響;平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RELN對(duì)miR-218 PC-3 CSCs克隆形成能力的影響;Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RELN對(duì)miR-218 PC-3 CSCs細(xì)胞遷移侵襲能力的影響;裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RELN對(duì)miR-218 PC-3 CSCs體內(nèi)成瘤能力的影響。結(jié)果:(一)組織樣品qRT-PCR結(jié)果顯示,前列腺癌組織中miR-218的表達(dá)顯著低于癌旁組織標(biāo)本(P0.05)。(二)流式檢測(cè)結(jié)果表明,免疫磁珠分選法分選出的前列腺癌干細(xì)胞群中,CD44+/CD133+細(xì)胞達(dá)到98.2%,qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明,在前列腺癌干細(xì)胞中miR-218的表達(dá)降低,與非前列腺癌干細(xì)胞之間比較具有顯著性差異(P0.05)。(三)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染miR-218 mimics細(xì)胞中miR-218的表達(dá)水平是對(duì)照miR-NC組的近20倍,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。(四)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與miR-NC組比較,miR-218 mimics組細(xì)胞增殖能力顯著降低(p0.01);平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與miR-NC組比較,miR-218 mimics組細(xì)胞克隆形成能力顯著降低(p0.01);腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與miR-NC組比較,miR-218 mimics組細(xì)胞腫瘤球成球能力顯著降低(p0.01);Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與miR-NC組比較,miR-218 mimics組細(xì)胞遷移侵襲能力顯著降低(p0.01);裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與miR-NC組比較,miR-218 mimics組細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力顯著降低(p0.01)。(五)通過(guò)軟件在線預(yù)測(cè)篩選RELN為miR-218新的下游靶基因;雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,野生型組熒光強(qiáng)度顯著降低,而突變組無(wú)明顯變化;Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,對(duì)比miR-NC組,miR-218 mimics組細(xì)胞中RELN蛋白降低,miR-218 inhibitor組細(xì)胞中RELN蛋白明顯升高。(六)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與miR-218組比較,miR-218+RELN組細(xì)胞增殖能力顯著升高(p0.01);平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與miR-218組比較,miR-218+RELN組細(xì)胞克隆形成能力顯著升高(p0.01);Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與miR-218組比較,miR-218+RELN組細(xì)胞遷移侵襲能力顯著升高(p0.01);裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與miR-218組比較,miR-218+RELN組細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力顯著升高(p0.01)。結(jié)論:(一)免疫磁珠分選法可以成功的分選出前列腺癌干細(xì)胞。(二)miR-218在前列腺癌組織和前列腺癌干細(xì)胞中低表達(dá)。(三)miR-218可抑制PC-3 CSCs增殖能力、克隆形成能力、成球能力、侵襲能力和體內(nèi)成瘤能力。miR-218抑制前列腺癌干細(xì)胞干性。(四)miR-218可以通過(guò)綁定RELN的3’UTR抑制RELN蛋白的表達(dá)。miR-218可以通過(guò)抑制RELN的表達(dá)調(diào)控前列腺癌干細(xì)胞干性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.25

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本文編號(hào)：1681804