本文選題：NDRG2　切入點：腦膠質(zhì)瘤　出處：《第四軍醫(yī)大學》2017年博士論文

【摘要】：腦膠質(zhì)瘤(glioblastoma,GBM)是目前已知的惡性程度最高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。常為原發(fā)性,在成人多見。同時也是顱內(nèi)出現(xiàn)率最高的惡性腫瘤,約占80%。神經(jīng)膠質(zhì)細胞多為其來源,屬于病死率和致殘率都較高的惡性腫瘤,預后極差。盡管目前采取了多種治療方法,即以手術(shù)治療為主,輔以化學治療,放射治療及生物治療等方法,而且隨著神經(jīng)影像學和神經(jīng)外科手術(shù)技術(shù)的提高,現(xiàn)狀有所改善,然而,惡性膠質(zhì)瘤的治療效果仍很不理想,預后不佳。替莫唑胺(temozolomide,TMZ)是化學治療藥物,屬于口服二代烷化劑的一種。其對各種實體性腫瘤治療效果顯著,目前已成為膠質(zhì)瘤化療的首選一線治療藥物。TMZ同步放療聯(lián)合輔助化療是新診斷膠質(zhì)瘤的標準治療方案。但即便如此,腦膠質(zhì)瘤的化療效果仍然有限。究其原因,第一,可能是血腦屏障的存在影響了藥物在腦中的分布和吸收。第二,可能是腫瘤耐藥基因的存在。因此腫瘤細胞對TMZ敏感性下降,產(chǎn)生耐藥,從而造成腫瘤進展或復發(fā),仍然是TMZ化療失敗的主要原因。與膠質(zhì)瘤內(nèi)在或獲得性耐藥的相關(guān)基因中,O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA-methyltransferase,MGMT)是目前相關(guān)研究中,發(fā)揮重要作用的一員,可以修復由烷化劑引起的DNA損傷,從而導致腫瘤對TMZ和BCNU等化療藥引起的DNA損傷減輕,從而導致耐藥性。MGMT啟動子甲基化,通過表觀遺傳學修飾,使MGMT基因沉默,從而增加腫瘤對烷化劑治療的敏感性機制已得到了廣泛認可。還有研究顯示MGMT啟動子甲基化與IDH的狀態(tài)和全基因組表觀遺傳變異(G-CIMP表型)密切相關(guān)。尋找能夠影響MGMT表達的相關(guān)基因或機制,從而進一步增強TMZ治療效果,成為一個被關(guān)注的方向和熱點。NDRG2基因?qū)儆谝粋�抑癌候選基因,在1999年通過消減雜交法被發(fā)現(xiàn)。在許多系統(tǒng)均見其與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān),如肺癌,結(jié)腸癌,乳腺癌,胃癌等等。在惡性膠質(zhì)瘤細胞系中,也發(fā)現(xiàn)NDRG2表達明顯下降,同時體外外源性過表達NDRG2能夠抑制抑制膠質(zhì)瘤增殖。隨后還在腦膜瘤中發(fā)現(xiàn)NDRG2下調(diào)。NDRG2啟動子甲基化,被認為與NDRG2轉(zhuǎn)錄水平下降呈高相關(guān)性。除了NDRG2啟動子高甲基化,NDRG2還通過上調(diào)組蛋白乙酰化來調(diào)控膠質(zhì)瘤生長。NDRG2表達水平與腦腫瘤病理分級呈負相關(guān),與星形膠質(zhì)細胞瘤病人的生存率呈正相關(guān)。對于NDRG2與MGMT之間關(guān)系,目前尚不清楚,亦鮮見相關(guān)文獻報道,缺乏相關(guān)基礎工作,我們的研究可以為提高TMZ治療腦膠質(zhì)瘤敏感性,探索與其相關(guān)的新的協(xié)同因子,增強其治療效果,改善病人預后提供新的方向和策略。基于以上既往研究結(jié)果,我們探求NDRG2基因是否在腦膠質(zhì)瘤患者的TMZ化療過程中發(fā)揮作用,是否與MGMT相關(guān),其又扮演何種角色,通過什么機制產(chǎn)生?為解析這些科學問題,我們開展了以下研究。【目的】1.明確NDRG2與腦膠質(zhì)瘤TMZ化療療效的相關(guān)性。2.探索NDRG2促使腦膠質(zhì)瘤對TMZ化療藥物敏感性增加的因素。3.解析NDRG2調(diào)控MGMT的分子信號通路。4.在TMZ耐藥腦膠質(zhì)瘤細胞中闡明NDRG2與MGMT關(guān)系。【方法與結(jié)果】1.NDRG2增強TMZ對腦膠質(zhì)瘤的敏感性(1)構(gòu)建NDRG2過表達和對照組Cherry細胞系選用p Lenti6.3/V5-DEST慢病毒表達載體,成功構(gòu)建了U87-NDRG2細胞,U87-Cherry細胞,A172-NDRG2細胞,A172-Cherry細胞,T98G-NDRG2細胞,T98G-Cherry細胞,U251-NDRG2細胞,U251-Cherry細胞。同時利用q RT-PCR檢測NDRG2的m RNA表達情況,利用Western blot檢測NDRG2蛋白表達情況。(2)NDRG2促進TMZ對腦膠質(zhì)瘤的治療敏感性前期研究顯示NDRG2對腦膠質(zhì)瘤細胞具有抑制其增殖的現(xiàn)象,那么在使用TMZ后的趨勢如何,有無其他變化?NDRG2過表達是否增強TMZ對腦膠質(zhì)瘤的殺傷能力?我們從測定細胞生長及殺傷曲線,檢測細胞周期和凋亡指標等方面評價。通過實驗,檢測MTT指標,觀察細胞生長趨勢。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在U87細胞中,在給予TMZ,時間持續(xù)24h的條件下,細胞的相對生長活力隨著加入TMZ濃度的增加而降低,但這個現(xiàn)象局限于0-400umol/L的濃度范圍內(nèi),在400-800umol/L的濃度范圍內(nèi),曲線開始變得平坦,提示到達一定程度后,濃度不再成為影響細胞活力的主要因素。同時觀察到NDRG2組的相對細胞活力較Cherry組降低。在加入TMZ,濃度為400umol/L,持續(xù)5天的MTT檢測發(fā)現(xiàn):加藥后NDRG2過表達組的相對生長活力顯著低于Cherry細胞。在給予TMZ處理24h后,我們觀察到在U87細胞中,不論是加藥組,還是未加藥的對照組,NDRG2過表達組的凋亡率都明顯高于Cherry組。并且加藥組的凋亡率明顯高于對照組。在T98G細胞中,亦觀察到同樣的趨勢。接著,我們給予不同濃度的TMZ,作用于U87細胞,在一定范圍內(nèi),發(fā)現(xiàn)隨著給藥濃度的升高,凋亡率也有隨之上升的趨勢。NDRG2過表達組的凋亡率高于Cherry組。在前期的工作中,我們課題組在觀察流式細胞儀檢測結(jié)果時,曾發(fā)現(xiàn)NDRG2過表達能夠影響細胞周期。在加入TMZ后,細胞周期的分布情況結(jié)果發(fā)現(xiàn):NDRG2過表達組與對照組相比,G1期比率增高,但加入藥物及藥物濃度的不同并未發(fā)現(xiàn)對周期有明顯的影響。該部分實驗提示NDRG2能夠提高TMZ對腦膠質(zhì)瘤的敏感性,使細胞增殖能力下降,凋亡率增高。2.NDRG2通過阻礙MGMT上調(diào)使TMZ療效增強(1)不同膠質(zhì)瘤細胞中NDRG2、MGMT及NF-κB表達在第一部分我們發(fā)現(xiàn)在使用TMZ藥物作用的情況下,NDRG2過表達能夠顯著提高TMZ對細胞的殺傷作用,抑制腦膠質(zhì)瘤的生長,促進其細胞的凋亡。那么NDRG2是通過何種機制來產(chǎn)生這種作用的呢?眾所周知,MGMT是一個與TMZ治療膠質(zhì)瘤產(chǎn)生用藥抵抗乃至耐藥關(guān)系密切的基因,它能修復TMZ造成的DNA損傷。在正常的人體及動物組織中,MGMT能起到保護作用,避免烷化劑損傷,阻止癌癥產(chǎn)生,在腫瘤組織中,也避免烷化劑類化療藥物損傷,就會出現(xiàn)耐藥。因此,我們設想:NDRG2是否通過調(diào)節(jié)MGMT的表達來影響TMZ對腦膠質(zhì)瘤細胞的療效?于是我們進行了相關(guān)實驗,目的在于觀察TMZ作用于腦膠質(zhì)瘤細胞后,MGMT的表達變化情況與NDRG2的關(guān)系。我們觀察了U87、T98G、U251、A172這幾個細胞系中NDRG2和MGMT的本底表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在T98G細胞中內(nèi)源性MGMT表達明顯,而U87、U251、A172細胞系MGMT表達極低,甚至觀察不到。(2)U87和T98G分別加入TMZ后MGMT的m RNA及蛋白表達在U87細胞中,Cherry組加入TMZ后MGMT表達升高,NDRG2組加入TMZ后MTMT表達略有升高。但在加入TMZ后,我們可以明顯地觀察到NDRG2組MGMT表達較Cherry組降低。在T98G,U251及A172細胞中我們可以觀察到同樣的現(xiàn)象。因此,我們認為NDRG2在TMZ給藥情況下的腦膠質(zhì)瘤中可能阻礙MGMT的表達上調(diào)。3.NDRG2調(diào)控MGMT的機制研究NDRG2在甲基化水平對MGMT的調(diào)控觀察在觀察到NDRG2與MGMT之間存在相關(guān)性的前提下,我們關(guān)注NDRG2與MGMT之間是通過何種通路介導。既往研究顯示MGMT啟動子甲基化是MGMT表達活性下降的一個重要原因。因此我們首先從甲基化的角度研究了NDRG2是否通過促進MGMT甲基化水平提高,從而減低MGMT表達活性,增加腦膠質(zhì)瘤對TMZ的敏感性。NDRG2也可以通過抑制PI3K/AKT通路來抑制腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展,還曾有文獻報道NF-κB可能是MGMT介導的烷化劑耐藥過程中的主要作用因子。故我們從這幾個方面去探尋NDRG2調(diào)控MGMT的介導路徑。我們利用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑GSK343處理細胞,它能夠與SAM競爭,選擇性地抑制EZH2,是一種組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,EZH2的高表達或者EZH2的突變曾在許多癌癥中被發(fā)現(xiàn),顯示出EZH2是治療癌癥的一個可能靶點。可以看到:在未加TMZ情況下,MGMT表達受GSK343影響而升高;在加入TMZ情況下,MGMT在NDRG2組和對照組中均升高,但加入GSK343時兩組并無明顯差異。說明:NDRG2可能不是通過GSK343這條甲基化途徑發(fā)揮作用。5-AZA屬于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,在TMZ存在的情況下,NDRG2如果通過甲基化MGMT使其失活表達下降,使用甲基化抑制劑后MGMT下降趨勢應該減少,但實驗結(jié)果并非如此,表明可能不是通過該途徑發(fā)揮作用。(2)NDRG2在AKT通路與MGMT的調(diào)控觀察既往曾有研究者發(fā)現(xiàn)NDRG2可以通過抑制AKT通路來抑制腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展,我們分別在U87和T98G細胞中,設立NDRG2過表達組和相應對照組,觀察AKT和p-AKT蛋白表達情況。結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。目前沒有發(fā)現(xiàn)證據(jù)支持NDRG2通過AKT通路影響MGMT。(3)NDRG2在NF-κB通路對MGMT的調(diào)控觀察在我們所采用的腦膠質(zhì)瘤細胞U87和T98G中,可以觀察到在Cherry組,加入TMZ后MGMT明顯升高,在NDRG2組,加入TMZ后MGMT亦有所上升。但觀察比較加入TMZ的Cherry組及NDRG2組,可以看到NDRG2組的MGMT較Cherry組低。p-p65(磷酸化的NF-κB亞基p65)也顯示了同樣的趨勢。TNF-α可以刺激NF-κB的表達,在U87和T98G細胞中可以觀察到在加入TNF-α后,MGMT的表達較加藥前明顯上升。JSH-23屬于NF-ΚB轉(zhuǎn)錄活性抑制劑,在U87和T98G細胞中可以觀察到在加入JSH-23后,MGMT的表達較加藥前明顯下降,且與p-p65的變化趨勢基本一致。從一定程度上說明MGMT可能受到NF-κB通路的正向調(diào)控。4.TMZ耐藥細胞中NDRG2與MGMT的表達情況U251耐藥細胞與親本細胞進行生長曲線的比較,發(fā)現(xiàn)隨著時間向前推進,耐藥細胞U251的增殖能力明顯高于親本細胞,說明耐藥細胞的增殖速率變快,惡性程度更高。U251耐藥細胞與親本細胞相比,在給予TMZ的情況下,隨著TMZ藥物作用濃度的增高,其殺傷效率出現(xiàn)了明顯的差異,耐藥細胞組明顯低于親本組。說明耐藥細胞對TMZ抵抗性更強,治療效果會變差。U251耐藥細胞中MGMT表達明顯上升,NDRG2表達下降。在給予TMZ作用后,耐藥細胞中NDRG2組的MGMT可以觀察到表達下降,也從另一個角度印證了NDRG2增強U251耐藥細胞藥物敏感性是通過調(diào)控MGMT而實現(xiàn)的。【結(jié)論】通過本課題以上的研究內(nèi)容和結(jié)果,發(fā)現(xiàn)NDRG2可能阻礙TMZ使用后MGMT上調(diào),來提高TMZ治療腦膠質(zhì)瘤的敏感性,這一過程可能通過NDRG2抑制NF-κB信號通路繼而阻礙MGMT上調(diào)來實現(xiàn)。但未發(fā)現(xiàn)該過程與AKT通路有關(guān),亦未發(fā)現(xiàn)其依賴于MGMT甲基化。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.41
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本文編號：1681167