本文選題：肝母細(xì)胞瘤　切入點(diǎn)：蛋白質(zhì)血清標(biāo)記物　出處：《鄭州大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：1研究背景與研究目的肝母細(xì)胞瘤患者的生存率都隨著其分期的升高而下降,目前常用的診斷、判斷預(yù)后的血清標(biāo)志物是甲胎蛋白,但在多種疾病及正常新生兒、小嬰兒中均升高,特異性較低。由此可見,利用現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)技術(shù)尋找一種高特異性、高敏感性的肝母細(xì)胞瘤早期檢測方法迫在眉睫。蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤中的研究可以用于疾病早期診斷、療效監(jiān)測和預(yù)后判斷等方面。目前,已有成功檢測出腎母細(xì)胞瘤、卵巢癌、乳腺癌等癌癥的生物學(xué)標(biāo)記物。本研究組前期應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)對腎母細(xì)胞瘤血清、瘤體組織進(jìn)行了深入的研究,研究得出的生物學(xué)標(biāo)記物目前已進(jìn)入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段,試驗(yàn)結(jié)果初步表明蛋白質(zhì)組學(xué)可篩選、鑒定出可靠的高特異性、高敏感性標(biāo)記物;本實(shí)驗(yàn)室前期蛋白質(zhì)組學(xué)已初篩出肝母細(xì)胞瘤的血清生物標(biāo)記物,本研究進(jìn)一步細(xì)化分組,深入研究,驗(yàn)證前期試驗(yàn)結(jié)果,并對該標(biāo)記物在不同分期、不同手術(shù)方式、不同診療階段患者的血清學(xué)生物表達(dá),進(jìn)一步研究該標(biāo)記物與肝母細(xì)胞瘤的關(guān)系及對腫瘤的影響。2材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料肝母細(xì)胞瘤患者血清樣本294例份,健康對照組血清80例份。分為術(shù)前組(根據(jù)pre-text分期:I期10例,II期17,III期38例、IV期15例)、術(shù)后組、化療組、治愈組、復(fù)發(fā)組。取材條件:晨起、空腹、外周靜脈血5ml,4℃下靜置1h,3000r/min離心15min,取上清液。所有病理結(jié)果均經(jīng)過兩次病理學(xué)檢驗(yàn)無誤。2.2.1肝母細(xì)胞瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物的篩選及其表達(dá)強(qiáng)度對比血清標(biāo)本在冰(水)浴上緩慢融解,離心,加樣、混勻血清樣本與U9處理液;混勻期間將蛋白質(zhì)芯片裝入96孔蛋白質(zhì)芯片工作支架Bio-processor中,記錄芯片編號;每孔中加入Na AC(100mmol/L,p H=4)200μl,置入曾析柜振蕩平衡(600rpm,室溫,5min),去除液體,重復(fù)操作平衡一次。取樣本100μl,U9處理,加入芯片,置于層析柜1h,快速拍干,加入Binding Buffer200μl振蕩(600rpm,室溫,5min),甩去殘液,快速拍干,重復(fù)操作2次。清洗、甩干、置于Bio-processor中,干燥后加入1μl的SPA溶液(50%),重復(fù)一次此操作,待自然干燥即可在SELDI-TOF-MAS平臺上檢測。設(shè)置SELDI-TOF-MS參數(shù),將結(jié)合好待測樣品的蛋白質(zhì)芯片裝入SELDITOF-MS中進(jìn)行檢測,對血清差異性蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選。采用Ciphergen Biosystems軟件3.1版本原始數(shù)據(jù)進(jìn)行校正,采用ZUCIPDAS網(wǎng)絡(luò)服務(wù)軟件分析蛋白質(zhì)芯片數(shù)據(jù),得到樣本中各個(gè)m/z及其對應(yīng)的蛋白質(zhì)峰值,將m/z差異小于0.3%的歸為同一類。質(zhì)譜數(shù)據(jù)過濾噪音,聚類分析,使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析。再經(jīng)過SVM篩選出youden指數(shù)最高的組合模型,得出肝母細(xì)胞瘤特異性血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物,同時(shí)對不同組別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,對比該標(biāo)記物在肝母細(xì)胞瘤不同分期、不同手術(shù)方式、不同診療階段患兒血清中的表達(dá)差異。2.2.2肝母細(xì)胞瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物的純化與鑒定取目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)量較高的血清樣本作為分離純化對象。取100μl血清樣品,將血清樣本用ACN沉淀大分子蛋白質(zhì),用C18反相高壓液相色譜柱對經(jīng)上述處理后的血清樣品進(jìn)行分離純化,用EP管收集對應(yīng)于HPLC圖上峰值中的蛋白質(zhì),真空濃縮至20μl,進(jìn)一步檢測、找出目標(biāo)蛋白質(zhì)所在的樣本。在純化后的目標(biāo)蛋白質(zhì)內(nèi),依次加入尿素、DTT、NH4HCO3、胰酶等,37℃酶解過夜,終止酶解反應(yīng),離心取上清,加入到C18蛋白質(zhì)樣品檢測的梯度洗脫柱,與2D-LC-LTQ-MS系統(tǒng)串聯(lián),檢測肽段質(zhì)荷比圖譜,通過數(shù)據(jù)庫檢索,得到相匹配的蛋白質(zhì)。2.2.3肝母細(xì)胞瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物的驗(yàn)證及動(dòng)態(tài)對比2.2實(shí)驗(yàn)方法采用ELISA方法對每組隨機(jī)抽樣進(jìn)行檢測。取標(biāo)準(zhǔn)品、樣品各100μl分別加入預(yù)包被抗人Apo A-I抗體的96孔板中;稀釋,孵育,洗板,依次加入作用液體,直至加終止液終止顯色反應(yīng)。讀出各孔吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品濃度。3結(jié)果3.1肝母細(xì)胞瘤血清蛋白標(biāo)記物的篩選本試驗(yàn)結(jié)果得出m/z峰為9348Da的蛋白質(zhì)或肽段為肝母細(xì)胞瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物。3.2目標(biāo)蛋白標(biāo)記物在肝母細(xì)胞瘤不同治療階段患兒血清中的表達(dá)對比對對照組、術(shù)前組、術(shù)后組、化療組、治愈組、復(fù)發(fā)組中的m/z 9348Da蛋白質(zhì)標(biāo)記物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,該標(biāo)記物在術(shù)前組、術(shù)后組、復(fù)發(fā)組中呈現(xiàn)低表達(dá);在對照組、化療組、治愈組中高表達(dá);表達(dá)強(qiáng)度分別為3893.21±593.03、1713.31±316.55、2213.85±247.15、2996.72±541.58、3610.36±310.07、913.37±230.72,上述各組兩兩對比,除術(shù)前組、術(shù)后組、復(fù)發(fā)組差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外,其他各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.3目標(biāo)蛋白質(zhì)標(biāo)記物在不同分期肝母細(xì)胞瘤患兒血清中的表達(dá)對比對各組進(jìn)行上述方法篩選并統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,得出質(zhì)荷比為9348Da的蛋白質(zhì)或肽段在各組中的表達(dá)差異。術(shù)前pre-text分期篩選得出I期、II期、III期、IV期表達(dá)強(qiáng)度分別為2524.12±679.42、1718.90±418.62、1268.11±399.09、635.91±237.56,I期、II期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03860.01),其余任意相鄰兩組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01。3.4肝母細(xì)胞瘤血清標(biāo)記物的純化及鑒定將蛋白質(zhì)經(jīng)高效液相色譜分析純化、收集,找出質(zhì)荷比為9348Da的樣品,將找到的質(zhì)荷比為9348Da的蛋白質(zhì)或肽段進(jìn)行酶解并通過2D-LC-LTQMS系統(tǒng)檢測,與數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)其為Apo A-I的一個(gè)肽段。3.5不同分期肝母細(xì)胞瘤術(shù)前血清中蛋白質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)量的對比取肝母細(xì)胞瘤不同分期血清樣本各10個(gè),應(yīng)用ELISA法檢測各組Apo A-I蛋白質(zhì)的濃度,結(jié)果示I期、II期、III期、IV期依次為154.14±34.45μg/m L,130.51±31.37μg/m L,86.32±14.44μg/m L,32.87±16.44μg/m L,相對于正常對照組均為低表達(dá),表達(dá)強(qiáng)度依次降低,且各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.6不同治療階段血清中蛋白質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)量的對比取正常對照組、術(shù)前組、術(shù)后組、化療組、治愈組、復(fù)發(fā)組的血清樣品各10個(gè),應(yīng)用ELISA法檢測各組Apo A-I蛋白質(zhì)的濃度,結(jié)果示各組蛋白質(zhì)濃度分別為正常對照組為235.34±14.42μg/m L;術(shù)前組為81.26±17.18μg/m L;術(shù)后組110.52±17.47μg/m L,化療組229.02±7.65μg/m L;治愈組222.14±20.23μg/m L,復(fù)發(fā)組90.63±13.58μg/m L。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示:治愈組與正常組血清中Apo A-I蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.01),其余各組與正常組中均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.01);復(fù)發(fā)組與術(shù)前組血清中Apo A-I蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.01),其余各組與術(shù)前組中均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.01);術(shù)后組、化療組中Apo A-I蛋白表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.01)。3.7不同手術(shù)方式患兒不同階段血清中蛋白質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)量的對比取試驗(yàn)中III、IV期患兒根據(jù)不同的手術(shù)方式分為血管結(jié)扎組及血管修補(bǔ)組,應(yīng)用ELISA法對兩組不同階段血清組Apo A-I蛋白質(zhì)的濃度做出檢測,結(jié)果顯示:兩組術(shù)前差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;術(shù)后及化療后濃度均有升高,血管修補(bǔ)組較結(jié)扎組升高較多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;兩組治愈后的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但臨床資料顯示,結(jié)扎組總治愈率較修補(bǔ)組稍低。3.8不同預(yù)后患兒血清中蛋白質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)量的對比取預(yù)后不良組、預(yù)后良好組血清各10份,應(yīng)用ELISA法檢測各組Apo A-I蛋白質(zhì)的濃度,結(jié)果顯示:分別為預(yù)后不良組:39.17±16.92μg/m L,預(yù)后良好組:97.38±41.83μg/m L;二者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.01)。4結(jié)論1.本研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比為9348Da的蛋白質(zhì)或肽段為肝母細(xì)胞瘤特異性血清標(biāo)記物。2.質(zhì)荷比為9348Da的蛋白質(zhì)或肽段經(jīng)過鑒定其為Apo A-I,它在肝母細(xì)胞瘤患兒血清中的表達(dá)與健康兒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,可作為HB血清生物學(xué)標(biāo)記物應(yīng)用于臨床,對構(gòu)建肝母細(xì)胞瘤診療的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建有臨床意義。3.Apo A-I的含量在肝母細(xì)胞瘤患兒與正常兒血清中存在的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在肝母細(xì)胞瘤不同期別患兒中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,不同手術(shù)方式、治療不同時(shí)期的差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,不同預(yù)后的患兒術(shù)前該蛋白質(zhì)表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.不同手術(shù)方式患兒術(shù)后該標(biāo)記物的含量差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其差別與臨床預(yù)后吻合,該結(jié)論支持手術(shù)切除腫瘤對肝母細(xì)胞瘤生存率起重要作用,且血管修補(bǔ)是III、IV期患兒手術(shù)中的重要技術(shù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：1678089