本文選題：肝癌　切入點(diǎn)：小柴胡湯　出處：《福建中醫(yī)藥大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的：通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究小柴胡湯對(duì)肝癌多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用,并探討其機(jī)制及作用靶點(diǎn)。方法：1.體外實(shí)驗(yàn)：通過MTT法檢測(cè)肝癌親本細(xì)胞BEL-7402及耐藥細(xì)胞株BEL-7402/5-FU的細(xì)胞活力,應(yīng)用SPSS軟件計(jì)算耐藥指數(shù)和小柴胡湯的逆轉(zhuǎn)倍數(shù),驗(yàn)證BEL-7402/5-FU耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性以及小柴胡湯對(duì)化療藥物的逆轉(zhuǎn)耐藥作用;MTT法檢測(cè)小柴胡湯對(duì)耐藥細(xì)胞的活力的影響,倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小柴胡湯對(duì)耐藥細(xì)胞存活能力的影響,流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期分布研究小柴胡湯對(duì)BEL-7402/5-FU耐藥細(xì)胞增殖的影響；Hoechst33258染色觀察小柴胡湯對(duì)BEL-7402/5-FU耐藥細(xì)胞凋亡的影響；Annexin V-PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡研究小柴胡湯對(duì)BEL-7402/5-FU細(xì)胞凋亡的影響；采用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)ATP含量；高效液相色譜儀(HPLC)檢測(cè)小柴胡湯對(duì)細(xì)胞內(nèi)5-FU蓄積的影響；流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)小柴胡湯對(duì)細(xì)胞內(nèi)阿霉素(ADM)和羅丹明(Rho123)濃度的影響。通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western Blot法檢測(cè)小柴胡湯對(duì)Bax、Bcl-2、CyclinGl及ABCB1(p-gp)、ABCC1(MRP1)、ABCG2(BCRP)在mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：分別將BEL-7402細(xì)胞及其耐藥株BEL-7402/5-FU細(xì)胞接種于裸鼠腋下建立裸鼠的皮下移植瘤模型,用5-FU (20 mg/kg)連續(xù)干預(yù)21天,檢測(cè)兩種移植瘤裸鼠的體重、瘤體變化和瘤重等觀察耐藥細(xì)胞建立的皮下移植瘤組織的耐藥性；建立裸鼠的耐藥移植瘤模型,按照體重隨機(jī)分為對(duì)照組、5-FU組(20mg/kg)、小柴胡湯組(XCHT, 14.2 g/kg)和聯(lián)合給藥(5-FU+XCHT)組,分別給藥21天,檢測(cè)體重變化評(píng)估藥物的毒副作用,觀察和測(cè)量移植瘤裸鼠的腫瘤體積和重量評(píng)估小柴胡湯對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響；通過TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling (TUNEL)法檢測(cè)小柴胡湯對(duì)耐藥移植瘤組織細(xì)胞凋亡的影響,應(yīng)用免疫組織化學(xué)法(IHC)研究小柴胡湯對(duì)耐藥移植瘤組織Ki-67表達(dá)的影響；通過RT-PCR和Western-Blot法檢測(cè)小柴胡湯對(duì)Bax、Bcl-2、yclinGl及ABCB1(p-gp)、ABCC1(MRP1)、 ABCG2(BCRP) mRNA和蛋白表達(dá)的影響。3.靶點(diǎn)驗(yàn)證：繪制BEL-7402和BEL-7402/5-FU細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,分別計(jì)算其倍增時(shí)間：qPCR檢測(cè)BEL-7402和BEL-7402/5-FU細(xì)胞及其移植瘤組織miR-122的表達(dá)；BEL-7402和BEL-7402/5-FU細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染inhibitor-miR-122(ASO-miR-122)或mimics-miR-122,檢測(cè)miR-122表達(dá)及對(duì)化療藥物耐藥性；觀察BEL-7402/5-FU細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimics-miR-122后的細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞數(shù)改變,DAPI染色和Annexin V-PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)miR-122對(duì)細(xì)胞凋亡影響；克隆形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期檢測(cè)miR-122對(duì)細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Rho123和ADM的蓄積情況,觀察miR-122對(duì)藥物外排功能的影響。采用qPCR和Western Blot法檢測(cè)miR-122對(duì)靶基因Bax、CDK4、CyclinGl和ABCB1表達(dá)的影響。結(jié)果：1、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：(1)BEL-7402/5-FU細(xì)胞經(jīng)5-FU、 ADM和DDP干預(yù)48 h后的IC50均顯著大于BEL-7402細(xì)胞,耐藥指數(shù)(RI)分別為6501.99,31.73和13.82；(2)0.5 mg/mL或1.0 mg/mL小柴胡湯分別與5-FU和ADM聯(lián)合干預(yù)BEL-7402和BEL-7402/5-FU,與單獨(dú)使用5-FU和ADM相比較,兩株細(xì)胞的ICs0均顯著降低,0.5 mg/mL或1.0 mg/mL小柴胡湯對(duì)5-FU和ADM的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別是1.66,3.44和1.50,5.58,相對(duì)逆轉(zhuǎn)率分別為39.88%,71.34%和34.11%,84.51%;(3)小柴胡湯抑制BEL-7402/5-FU細(xì)胞增殖：MTT檢測(cè)細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)小柴胡湯顯著降低BEL-7402/5-FU細(xì)胞活力,呈劑量和時(shí)間依賴性；倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)不同濃度小柴胡湯均可以不同程度抑制細(xì)胞生長(zhǎng),且隨著濃度增高,其抑制程度也越強(qiáng)；集落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度小柴胡湯均能夠不同程度減少集落形成數(shù)量,影響細(xì)胞的生存能力；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)小柴胡湯能夠改變細(xì)胞周期分布,使BEL-7402/5-FU細(xì)胞阻滯于G2/M期;小柴胡湯下調(diào)CyclinGl的表達(dá)。(4)小柴胡湯誘導(dǎo)BEL-7402/5-FU細(xì)胞凋亡：熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)小柴胡湯能夠誘導(dǎo)BEL-7402/5-FU細(xì)胞凋亡,不同濃度小柴胡湯濃度干預(yù)可使細(xì)胞密度減小,核高染(亮染)的細(xì)胞數(shù)增加；Annexin V-PI凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示小柴胡湯誘導(dǎo)BEL-7402/5-FU細(xì)胞早期凋亡,且呈劑量依賴；小柴胡湯上調(diào)Bax表達(dá),下調(diào)Bc1-2表達(dá)。(5)小柴胡湯抑制藥物泵的外排作用：小柴胡湯能夠顯著增加5-FU和ADM在BEL-7402/5-FU細(xì)胞內(nèi)的蓄積;小柴胡湯增加BEL-7402/5-FU細(xì)胞內(nèi)Rho123的蓄積；小柴胡湯顯著降低BEL-7402/5-FU細(xì)胞內(nèi)ATP的含量；小柴胡湯能夠顯著下調(diào)多藥耐藥相關(guān)基因ABCB1、 ABCC1及ABCG2的mRNA和蛋白表達(dá)。2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：(1)BEL-7402和BEL-7402/5-FU細(xì)胞移植瘤的體積和重量檢測(cè)結(jié)果提示BEL-7402/5-FU細(xì)胞移植瘤較BEL-7402細(xì)胞移植瘤具有更明顯的耐藥性,而小柴胡湯能夠顯著抑制移植瘤生長(zhǎng),表明小柴胡湯可以降低BEL-7402/5-FU細(xì)胞移植瘤的化療耐藥；(2)TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,小柴胡湯和聯(lián)合給藥均可以顯著增加TUNEL的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率,促進(jìn)耐藥移植瘤組織的細(xì)胞凋亡,5-FU對(duì)TUNEL的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率沒有明顯影響；(3)IHC檢測(cè)Ki-67表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)小柴胡湯能夠顯著增加Ki-67的陽(yáng)性表達(dá)率,抑制耐藥移植瘤細(xì)胞增殖,而5-FU對(duì)耐藥移植瘤組織的細(xì)胞增殖未見明顯變化：(4)RT-PCR和Western-blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)小柴胡湯能夠顯著下調(diào)Bcl-2、 cyclinGl和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCB1、ABCC1、ABCG2的表達(dá),上調(diào)Bax的表達(dá)；而5-FU對(duì)上述相關(guān)基因表達(dá)未見顯著影響。3、靶點(diǎn)驗(yàn)證：與BEL-7402細(xì)胞比較,BEL-7402/5-FU細(xì)胞倍增時(shí)間延長(zhǎng)17.04 h,且具有更高的耐藥性；BEL-7402/5-FU細(xì)胞或移植瘤組織miR-122表達(dá)降低,與BEL-7402細(xì)胞或移植瘤比較,分別降低0.57倍和0.61倍,小柴胡湯增加耐藥細(xì)胞或移植瘤中miR-122的表達(dá),分別升高2.36倍和2.82倍；BEL-7402和BEL-7402/5-FU細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染inhibitors-miR-122或mimics-miR-122后,miR-122表達(dá)分別降低0.71倍或升高2056.98倍；BEL-7402轉(zhuǎn)染inhibitors-miR-122后,對(duì)5-FU耐藥性沒有明顯改變,BEL-7402/5-FU細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimics-miR-122,在0-1200 μM范圍內(nèi),增加BEL-7402/5-FU對(duì)5-FU的敏感性；BEL-7402/5-FU細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimics-miR-122能夠抑制BEL-7402/5-FU細(xì)胞生長(zhǎng),增加其對(duì)5-FU的敏感性；miR-122能夠促進(jìn)BEL-7402/5-FU細(xì)胞細(xì)胞凋亡；miR-122可以抑制BEL-7402/5-FU細(xì)胞增殖；miR-122增加ADM和Rho123在BEL-7402/5-FU細(xì)胞內(nèi)的蓄積；miR-122調(diào)節(jié)靶基因Bax、CDK4、CyclinGl和ABCB1的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)論：1.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小柴胡湯能夠逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥；2.小柴胡湯逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥機(jī)制可能有以下幾個(gè)方面：(1)小柴胡湯顯著抑制耐藥細(xì)胞BEL-7402/5-FU細(xì)胞增殖；(2)小柴胡湯促進(jìn)耐藥細(xì)胞BEL-7402/5-FU細(xì)胞凋亡；(3)小柴胡湯抑制耐藥細(xì)胞BEL-7402/5-FU細(xì)胞藥物外排功能；(4)小柴胡湯調(diào)控miR-122及其靶基因促進(jìn)BEL-7402/5-FU凋亡,抑制細(xì)胞增殖及藥物的外排功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：福建中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：1677257