本文選題：NLRP3　切入點(diǎn)：PHF8　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景胃癌在發(fā)展中國(guó)家是癌癥死亡的主要原因,是影響我國(guó)人民健康的重大疾病。早期診斷困難是胃癌預(yù)后較差的主要原因。據(jù)美國(guó)國(guó)立癌癥研究所"監(jiān)測(cè)、流行病學(xué)和結(jié)果數(shù)據(jù)庫(kù)" SEER報(bào)道,2008年到2016年之間,I期胃癌患者的五年生存率為66.9%,而Ⅳ期患者的五年生存率驟降至5%,然而63%的胃癌患者一經(jīng)診斷即為晚期。因此揭示胃粘膜惡性轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制,是制定胃癌早期防控策略以及確定新的治療靶點(diǎn)的重要依據(jù)。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染是胃癌發(fā)生的一個(gè)危險(xiǎn)因素,已被世界衛(wèi)生組織/國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(WHO/IARC)認(rèn)定為一級(jí)致癌原,流行病學(xué)資料也顯示根除幽門螺桿菌感染可降低胃癌風(fēng)險(xiǎn)率,幽門螺桿菌致癌機(jī)制仍在探索中。然而,有一條規(guī)律值得關(guān)注,幽門螺桿菌相關(guān)的惡性轉(zhuǎn)化存在病理節(jié)點(diǎn)明晰的漸進(jìn)式演化過(guò)程,即"慢性淺表性胃炎(可控性炎癥)→慢性萎縮性胃炎伴腸上皮化生(非可控性炎癥)→不典型增生(癌前病變)→胃癌"。胃粘膜惡性轉(zhuǎn)化是胃內(nèi)環(huán)境因子(外因)與宿主調(diào)控應(yīng)答(內(nèi)因)交互作用的結(jié)果。幽門螺桿菌可以通過(guò)MMP-2/9、CCL2等招募免疫細(xì)胞至胃黏膜組織啟動(dòng)免疫應(yīng)答,促進(jìn)胃部炎癥進(jìn)展。炎癥部位浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞可以通過(guò)產(chǎn)生IL-1、IL-6和TNF-α等促進(jìn)炎癥向癌癥的轉(zhuǎn)化。因此"幽門螺桿菌—胃粘膜上皮細(xì)胞—免疫細(xì)胞"構(gòu)成的"胃區(qū)域感染炎癥微環(huán)境"是炎癌轉(zhuǎn)化以及胃癌進(jìn)展的趨動(dòng)力。宿主通過(guò)模式識(shí)別受體(PRRs)感應(yīng)病原微生物感染,PRRs識(shí)別病原微生物并向下游傳遞信號(hào),釋放成熟促炎因子如TNF-α、IL-6、IL-1β,引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)。已知有以下幾種模式識(shí)別受體Toll樣受體(TLRs:TLR2、TLR3、TLR4、TLR5 和 TLR9 等),NOD 樣受體(NLRs:NOD1、NOD2 和 NLRP3 等),C-型凝集素受體(CLRs)和維甲酸誘導(dǎo)基因(RLRs:RIG-1和MDA-5)參與調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生。其中NOD樣受體在感知幽門螺桿菌感染并介導(dǎo)炎性響應(yīng)與惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用的作用需要更多的探究。我們通過(guò)在OncoMine數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)胃癌各種類型的NOD樣受體分子進(jìn)行篩查,發(fā)現(xiàn)NLRP3在各種類型的胃癌中表達(dá)顯著上調(diào)。NLRP3又稱cryopyrin、PYPAF1或Nalp3,是NLR家族成員之一,與多種人類炎癥與自身免疫病發(fā)生密切相關(guān)。NLRP3炎性小體與腸道腫瘤、肝細(xì)胞癌和黑色素瘤等腫瘤密切相關(guān),此外NLRP3基因多態(tài)性和胃腸道腫瘤風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。幽門螺桿菌可激活NLRP3炎性小體,導(dǎo)致促炎因子IL-1β釋放。以上研究結(jié)果提示幽門螺桿菌感染激活的NLRP3炎性小體增強(qiáng)了胃癌風(fēng)險(xiǎn)性。然而,NLRP3與胃粘膜惡性轉(zhuǎn)化的內(nèi)在規(guī)律尚不明了。組蛋白修飾在癌癥的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中的作用越來(lái)越受到大家的關(guān)注,很多研究將靶向組蛋白去甲基化酶作為治療癌癥的新策略。我們通過(guò)對(duì)Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)中876例胃癌預(yù)后和組蛋白去甲基化酶相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)兩種組蛋白去甲基化酶KDM5C和PHF8與胃癌預(yù)后相關(guān)性最強(qiáng),而KDM5C和胃癌之間的關(guān)系已有報(bào)道,因此我們重點(diǎn)關(guān)注組蛋白去甲基化酶PHF8是否參與胃癌的進(jìn)展過(guò)程。作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄共激活子,PHF8是含有Jmjc結(jié)構(gòu)域的組蛋白去甲基化酶成員之一。本研究立足于解析幽門螺桿菌促進(jìn)組蛋白去甲基化酶PHF8表達(dá)介導(dǎo)胃癌進(jìn)展的調(diào)控機(jī)制。研究目的(一)從感染炎癥微環(huán)境的角度解析模式識(shí)別受體NLRP3高表達(dá)介導(dǎo)胃區(qū)域炎癌轉(zhuǎn)化的調(diào)控機(jī)制。(二)解析蛋白去甲基化酶PHF8介導(dǎo)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移與進(jìn)展的調(diào)控機(jī)制。方法和結(jié)果(一)幽門螺桿菌感染抑制組成性表達(dá)的miR-22促進(jìn)NLRP3表達(dá),進(jìn)而在巨噬細(xì)胞和胃上皮細(xì)胞中分別通過(guò)炎性小體依賴性(成熟釋放IL-1β)與炎性小體非依賴性(NLRP3入核轉(zhuǎn)錄調(diào)控CCND1)兩類機(jī)制,共同介導(dǎo)胃區(qū)域炎癌轉(zhuǎn)化。1.通過(guò)在OncoMine數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)胃癌各種類型的NOD樣受體分子進(jìn)行篩查,發(fā)現(xiàn)NLRP3在各種類型的胃癌中表達(dá)顯著上調(diào)。通過(guò)Western-blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胃癌中NLRP3表達(dá)顯著高于癌旁正常組織,胃癌細(xì)胞系中NLRP3表達(dá)顯著高于永生化的胃上皮細(xì)胞系(GES-1)。實(shí)時(shí)定量PCR分析發(fā)現(xiàn)胃癌中NLRP3表達(dá)顯著高于萎縮性胃炎組織,免疫組化分析發(fā)現(xiàn)NLRP3在胃炎向胃癌進(jìn)展的過(guò)程中逐步升高,并且NLRP3高表達(dá)的胃癌患者預(yù)后較差。體外克隆形成和體內(nèi)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞系中NLRP3高表達(dá)后增殖能力顯著升高。2.NLRP3在巨噬細(xì)胞中可被激活參與形成NLRP3炎性小體,進(jìn)而促進(jìn)IL-1β的釋放。體外克隆形成和Edu實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-1 β可顯著促進(jìn)胃上皮細(xì)胞的增殖。3.利用共聚焦顯微鏡在胃上皮細(xì)胞中觀察到NLRP3出現(xiàn)在細(xì)胞核中,分離胞漿胞核蛋白進(jìn)行Western-blot發(fā)現(xiàn)IL-1 β可顯著促進(jìn)NLRP3的入核。Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)提示CCND1啟動(dòng)子區(qū)存在兩個(gè)NLRP3的結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)時(shí)定量PCR和Western-blot發(fā)現(xiàn)NLRP3高表達(dá)后CCND1表達(dá)明顯上調(diào),而NLRP3干擾后CCND1表達(dá)明顯下調(diào)。雙熒光素酶和Chip實(shí)驗(yàn)證實(shí)NLRP3和CCND1的啟動(dòng)子區(qū)域有結(jié)合。4.通過(guò)對(duì)胃癌和萎縮性胃炎標(biāo)本的miRNA芯片分析和TargetScan預(yù)測(cè)一個(gè)炎癌轉(zhuǎn)化中明顯下調(diào)并有NLRP3潛在結(jié)合位點(diǎn)的miRNA,即miR-22。實(shí)時(shí)定量PCR分析發(fā)現(xiàn)胃癌中miR-22表達(dá)顯著低于萎縮性胃炎組織,胃癌細(xì)胞系中miR-22表達(dá)亦顯著低于永生化的胃上皮細(xì)胞系(GES-1)。實(shí)時(shí)定量PCR和Western-blot發(fā)現(xiàn)miR-22的類似物(mimics)可明顯抑制NLRP3的表達(dá),反之miR-22抑制物(inhibitor)則可明顯上調(diào)NLRP3的表達(dá)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-22的類似物(mimics)可明顯抑制NLRP3的3' UTR活性,反之miR-22抑制物(inhibitor)則可明顯上調(diào)NLRP3的3' UTR活性。5.Western-blot發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞中,miR-22 mimics可顯著抑制LPS所誘導(dǎo)的NLRP3的表達(dá)。Western-blot和ELISA證實(shí)在巨噬細(xì)胞中,miR-22 mimics可顯著抑制LPS和ATP誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活以及IL-1 β的釋放。6.體內(nèi)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-22類似物可以顯著逆轉(zhuǎn)NLRP3高表達(dá)胃癌細(xì)胞的增殖能力,同時(shí)顯著抑制NLRP3和CCND1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。7.實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組化分析發(fā)現(xiàn)NLRP3在幽門螺桿菌陽(yáng)性的萎縮性胃炎患者中表達(dá)明顯高于陰性者。實(shí)時(shí)定量PCR和Western-blot也證實(shí)在胃癌細(xì)胞系中,幽門螺桿菌可明顯誘導(dǎo)NLRP3的表達(dá),而在巨噬細(xì)胞中還可以誘導(dǎo)NLRP3炎性小體的激活以及IL-1 β的釋放。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明幽門螺桿菌在體內(nèi)亦可誘導(dǎo)NLRP3的表達(dá)。此外,幽門螺桿菌和IL-1 β均可顯著抑制上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中miR-22的表達(dá),從而和NLRP3表達(dá)之間形成一個(gè)正反饋,促進(jìn)炎癌轉(zhuǎn)化。(二)PHF8和β-catenin共同結(jié)合到上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化EMT相關(guān)基因vimentin啟動(dòng)子區(qū)促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而促進(jìn)胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移與進(jìn)展。1.通過(guò)對(duì)Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)中876例胃癌預(yù)后和組蛋白去甲基化酶相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)PHF8與胃癌預(yù)后相關(guān)性最強(qiáng)。通過(guò)對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析和免疫組化分析以及Western-blot發(fā)現(xiàn)胃癌中PHF8的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。Western-blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞系中PHF8表達(dá)顯著高于永生化的胃上皮細(xì)胞系(GES-1)。2.通過(guò)裸鼠皮下成瘤以及尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PHF8促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。3.體外克隆形成,創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)以及transwell實(shí)驗(yàn)證明PHF8干擾后胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力均明顯下降;PHF8高表達(dá)后胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力增強(qiáng),而PHF8組蛋白去甲基化酶活性突變的高表達(dá)質(zhì)粒(H247A)組這種效應(yīng)得到逆轉(zhuǎn)。4.Western-blot發(fā)現(xiàn)PHF8干擾后上皮標(biāo)志物(E-cadherin,ZO-1)明顯上調(diào),間質(zhì)標(biāo)志物(vimentin,ZEB-1和Slug)明顯下調(diào),而PHF8高表達(dá)后則相反,H247A組則可逆轉(zhuǎn)PHF8高表達(dá)的效應(yīng)。通過(guò)對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)在45對(duì)胃癌和癌旁組織中PHF8的表達(dá)和vimentin,ZEB-1和Slug均明顯正相關(guān)。實(shí)時(shí)定量PCR發(fā)現(xiàn)PHF8干擾后vimentin mRNA水平明顯下降,而PHF8高表達(dá)后則相反,H247A組則可逆轉(zhuǎn)PHF8高表達(dá)的效應(yīng)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)和Chip證明PHF8可以和vimentin啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合。IP證明PHF8和β-catenin存在物理性結(jié)合,5.免疫組化發(fā)現(xiàn)PHF8和vimentin在胃癌中的表達(dá)存在共定位,并且PHF8的表達(dá)在進(jìn)展期胃癌以及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中明顯增加。通過(guò)對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),PHF8的表達(dá)和vimentin表達(dá)之間明顯正相關(guān),且與腫瘤的大小,進(jìn)展程度,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及TNM分期均有明顯相關(guān)性。6.實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組化分析發(fā)現(xiàn)PHF8在幽門螺桿菌陽(yáng)性的萎縮性胃炎患者中表達(dá)明顯高于陰性者。實(shí)時(shí)定量PCR也證實(shí)在胃癌細(xì)胞系中,幽門螺桿菌可明顯誘導(dǎo)PHF8的表達(dá),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明幽門螺桿菌在體內(nèi)亦可誘導(dǎo)PHF8的表達(dá)。研究結(jié)論(一)我們證實(shí)miR-22是NLRP3表達(dá)以及NLRP3炎性小體激活的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,miR-22通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞中的NLRP3表達(dá)在調(diào)節(jié)胃部微環(huán)境和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用。幽門螺桿菌通過(guò)抑制組成性表達(dá)的miR-22進(jìn)而促進(jìn)NLRP3表達(dá)介導(dǎo)感染炎癥與惡性轉(zhuǎn)化。因此,靶向miR-22調(diào)節(jié)NLRP3的表達(dá)在胃癌的干預(yù)過(guò)程中具有重要意義。(二)胃癌中高表達(dá)的PHF8促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲,且與胃癌患者的較差預(yù)后相關(guān)。PHF8可以與和β-catenin共同結(jié)合到vimentin啟動(dòng)子區(qū)促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄,進(jìn)一步促進(jìn)胃癌的進(jìn)展。因此,我們揭示了胃癌進(jìn)展的一個(gè)新機(jī)制,提示PHF8也是胃癌防治過(guò)程中的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 Chun-Li Tang;Bo Hao;Guo-Xin Zhang;Rui-Hua Shi;Wen-Fang Cheng;;Helicobacter pylori tumor necrosis factor-α inducing protein promotes cytokine expression via nuclear factor-κB[J];World Journal of Gastroenterology;2013年03期

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本文編號(hào)：1667204