本文選題：乳腺癌　切入點：BEZ235　出處：《延邊大學》2016年博士論文

【摘要】：研究目的：通過體內(nèi)外實驗檢測BEZ235和多西他賽聯(lián)合用藥對乳腺癌細胞生物學行為的影響,分析其協(xié)同抑制腫瘤的作用及機制,并探討Mortalin蛋白在乳腺癌中的作用機制及其預后評估作用,為乳腺癌靶向治療提供新的藥物選擇。材料與方法：1)體外實驗：MTT及平板克隆實驗檢測BEZ235和多西他賽單獨或聯(lián)合用藥對乳腺癌細胞的增殖抑制作用；細胞劃痕實驗,細胞遷移實驗,細胞侵襲實驗觀察單獨或聯(lián)合用藥對細胞遷移的影響；Hoechst33342熒光染色法,Western blot實驗檢測藥物處理后的乳腺癌細胞凋亡的變化；Western blot實驗檢測BEZ235和多西他賽單獨或聯(lián)合用藥后PI3K/Akt/mTOR信號通路和EMT標志物分子的改變。RT-PCR實驗檢測不同乳腺癌細胞中Mortalin蛋白的差異表達,進一步以siMortalin方法沉默Mortalin的表達后檢測誘導EMT的能力,明確Mortalin蛋白與EMT的相關性。2)體內(nèi)實驗：首先,建立MDA-MB231乳腺癌細胞裸鼠移植瘤模型,隨機分成對照組、單獨用藥組和聯(lián)合用藥組(每組5只)。連續(xù)給藥4周后檢測腫瘤大小,并將腫瘤組織制成病理切片,免疫組化分析E-cadherin, p-AKT, p-S6, p-4ebp1, cleaved caspase 3蛋白的表達情況；其次,應用免疫組化方法檢測Mortalin蛋白在155例乳腺浸潤性導管癌中的表達情況,并分析其異常表達與乳腺癌臨床病理學特點之間的關系,繼而分析Mortalin蛋白表達對患者生存期的影響。結果：MTT結果顯示,BEZ235與多西他賽可協(xié)同抑制乳腺癌細胞株MDA-MB231和MDA-MB468的增殖；平板克隆實驗顯示,BEZ235與多西他賽可協(xié)同抑制乳腺癌的克隆形成能力；細胞劃痕實驗,細胞遷移實驗,細胞侵襲實驗結果表明聯(lián)合用藥可明顯抑制乳腺癌細胞的遷移能力；Hoechst33342熒光實驗表明聯(lián)合用藥可明顯誘導乳腺癌細胞的凋亡;Western blot實驗和免疫熒光實驗結果顯示BEZ235與多西他賽聯(lián)合用藥可下調PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白,上調PARP蛋白,下調Bcl2, Bax蛋白,促進caspase3,8,9蛋白的活化誘導凋亡的發(fā)生；此外,Western blot實驗和免疫熒光實驗結果也顯示BEZ235與多西他賽聯(lián)合用藥可抑制EMT的發(fā)生,下調snail, slug, twist和vimentin蛋白的表達,上調E-cadherin蛋白的表達；RT-PCR結果顯示,MDA-MB231細胞Mortalin的mRNA水平明顯高與其它乳腺癌細胞系；且Western blot實驗結果顯示, siMortalin方法沉默Mortalin的表達后可抑制EMT的發(fā)生；BEZ235與多西他賽可協(xié)同抑制MDA-MB231細胞的裸鼠移植瘤成瘤能力,而且聯(lián)合用藥組腫瘤組織壞死明顯增多,p-AKT, p-S6, p-4ebp1的表達明顯下調且cleaved caspase3, E-cadherin的表達明顯上調。免疫組織化學結果顯示,Mortalin蛋白主要定位于細胞漿,且在乳腺癌中的陽性率63.9%(99/155)明顯高于導管原位癌34.6%(18/52)及正常組織15.6%(7/45),差異具有顯著性,并與患者的組織分級、臨床分期和有無淋巴結轉移密切相關；生存期分析結果表明Mortalin蛋白的異常表達與乳腺癌的生存期密切相關。此外,多因素分析結果表明,Mortalin蛋白,臨床分期與HER2表達在乳腺癌中是重要的獨立風險因素。結論：1)BEZ235與多西他賽聯(lián)合應用可以協(xié)同抑制乳腺癌細胞的增殖；2)BEZ235與多西他賽聯(lián)合應用與誘導細胞凋亡密切相關,而且可以通過EMT抑制乳腺癌細胞的遷移；3) Mortalin蛋白在乳腺癌形成EMT過程中起著重要的作用,而且在乳腺癌中異常高表達,可以作為乳腺癌不良預后的分子標志物。
[Abstract]:Objective: To study effects of in vivo detection of the combination of BEZ235 and docetaxel on the biological behaviors of breast cancer cells, analysis of the synergistic effect and mechanism of tumor suppression, and to explore the mechanism of Mortalin protein in breast cancer and its prognostic role for breast cancer target to provide new drug treatment options. Materials and methods: 1) in vitro: inhibition of MTT proliferation and clonogenic assay for detection of BEZ235 and docetaxel alone or in combination on breast cancer cells; cell scratch assay, cell migration assay, cell invasion assay observed alone or combined effect on cell migration; Hoechst33342 fluorescence staining, the changes of drug Western blot assay after treatment apoptosis of breast cancer cells; Western blot assay, BEZ235 and docetaxel alone or in combination after PI3K/Akt/mTOR signal pathway The expression and change of.RT-PCR assay of EMT marker Mortalin protein in breast cancer cells to detect differences, the ability to induce EMT further to siMortalin silencing Mortalin expression, Mortalin protein clear correlation with EMT.2) in vivo: first, to establish the xenograft model of breast cancer MDA-MB231 cells in nude mice were randomly divided into control group., single drug group and combination group (n = 5). After 4 weeks of continuous administration of detection of tumor size and tumor tissue sections were prepared, immunohistochemical analysis of E-cadherin, p-AKT, p-S6, p-4ebp1, cleaved expression of caspase 3 protein; secondly, immunohistochemical method was used to detect the expression of Mortalin protein the situation of ductal carcinoma of the breast in 155 cases, and analyze the relationship between the expression and clinicopathological characteristics of breast cancer, and analysis of Mortalin protein expression in patients The effects of survival. Results: MTT results showed that BEZ235 and docetaxel match synergistic inhibition of MDA-MB231 and MDA-MB468 in breast cancer cell proliferation; experimental plate cloning, cloning BEZ235 and docetaxel competitively inhibit breast cancer collaborative forming ability; cell scratch test, cell migration assay, cell invasion assay results showed that migration the ability of combined drugs can inhibit breast cancer cells; Hoechst33342 fluorescence experiments show that combination therapy can induce apoptosis of breast cancer cells; Western blot assay and immunofluorescence results showed that BEZ235 and docetaxel combination therapy can regulate PI3K/Akt/mTOR signaling pathway protein, up-regulated PARP protein, down Bcl2, Bax protein, caspase3,8,9 protein activation induced promotion in addition, Western apoptosis; blot assay and immunofluorescence experiment showed that the combination of BEZ235 and docetaxel Occurrence of medication can inhibit EMT down-regulation of snail, slug, twist and the expression of vimentin protein, up-regulated E-cadherin protein expression; RT-PCR results showed that MDA-MB231 cell Mortalin mRNA levels were significantly higher with other breast cancer cell lines; Western and blot results showed that the expression siMortalin silencing Mortalin could inhibit EMT; BEZ235 and his West match synergistic inhibition of MDA-MB231 cells in nude mice tumorigenicity, and the combination group of tumor tissue necrosis increased significantly, p-AKT, p-S6, p-4ebp1 and cleaved significantly decreased expression of Caspase3 significantly up-regulated the expression of E-cadherin. Immunohistochemistry showed that Mortalin protein was mainly localized in the cytoplasm, and in the breast carcinoma the positive rate was 63.9% (99/155) was significantly higher than that of ductal carcinoma in situ (18/52) and 34.6% normal tissues 15.6% (7/45), the difference was significant, and with the patient The histological grade, clinical stage and lymph node metastasis; survival analysis showed that abnormal expression of Mortalin protein in breast cancer and survival are closely related. In addition, the results of multivariate analysis showed that Mortalin protein, clinical stage and the expression of HER2 in breast cancer is an important independent risk factor. Conclusion: 1) BEZ235 combined with docetaxel can inhibit the proliferation of breast cancer cells; 2) BEZ235 combined with docetaxel is closely related with the induction of apoptosis, and can inhibit the migration of breast cancer cells by EMT; 3) Mortalin protein plays an important role in the process of EMT in breast cancer, and high abnormal expression in breast cancer that can be used as molecular marker for poor prognosis of breast cancer.

【學位授予單位】：延邊大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：1662635