本文選題：食管鱗狀細(xì)胞癌　切入點(diǎn)：COX-2　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景中國(guó)是食管鱗狀細(xì)胞癌高發(fā)國(guó)家,據(jù)估計(jì),我國(guó)每年約有25萬(wàn)例新發(fā)食管癌病例。由于該病起病隱匿,早期一般沒(méi)有明顯的自覺(jué)癥狀,因此確診時(shí)多數(shù)患者都已發(fā)展至中期或晚期。對(duì)于早期的食管癌患者,目前臨床上主要采用以手術(shù)為主的根治性治療方法,而對(duì)于那些已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等情況的不適宜采取手術(shù)治療的中晚期患者,則首推以放化療為主的綜合治療。目前胸中段食管鱗癌的最主要治療措施依然是外科手術(shù),但手術(shù)的總體療效仍欠佳,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,食管鱗癌的5年總的生存率僅為30%左右,約一半以上的患者在手術(shù)后2年左右出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā),其中局部區(qū)域復(fù)發(fā)最常見(jiàn),以縱隔、鎖骨上、及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為主。盡管近年來(lái)食管癌的治療技術(shù)已經(jīng)有了較大的進(jìn)步,但食管癌惡性程度高,疾病進(jìn)展迅速,易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,患者的總體預(yù)后仍不容樂(lè)觀。所以研究食管鱗癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的分子生物學(xué)機(jī)制,對(duì)指導(dǎo)食管鱗癌患者選擇合適的治療方案和改善預(yù)后具有非常重要的臨床價(jià)值。環(huán)氧合酶(cyclooxygenase, COX),亦可稱之為前列腺素過(guò)氧化物合成酶,能調(diào)節(jié)前列腺素的合成,在前列腺素(PG)合成過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用,在其誘導(dǎo)下,花生四烯酸將被轉(zhuǎn)化成類(lèi)前列腺素(如血栓素等),從而能調(diào)節(jié)機(jī)體的生理代謝以及病理代謝過(guò)程。現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),細(xì)胞中環(huán)氧合酶主要有COX-1和COX-2兩種編碼基因。其中,在正常細(xì)胞中可檢測(cè)到COX-1基因表達(dá)的COX-1,其主要作用是輔助人體正常生理功能的維持。而COX-2則絕少在正常組織細(xì)胞中表達(dá),只有在異常的內(nèi)外環(huán)境的刺激下才被誘導(dǎo)性表達(dá)。在正常的生理狀態(tài)下,僅僅在腦組織和腎組織中可探及少量的COX-2蛋白。近些年年的研究證實(shí),在人類(lèi)許多癌前病變和惡性腫瘤中,COX-2均呈現(xiàn)高表達(dá),而且對(duì)腫瘤血管生成、細(xì)胞周期調(diào)控以及機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)均有不同程度的影響,因而在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到非常重要的作用。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)環(huán)氧合酶與食管鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)行為的研究仍不多見(jiàn)。本課題應(yīng)用免疫組化法以及Western blot等技術(shù)檢測(cè)環(huán)氧合酶COX-2在食管鱗狀細(xì)胞癌組織以及正常食管粘膜組織中的表達(dá)情況,并結(jié)合入組患者的臨床病理資料及完整的隨訪資料,意在探討COX-2表達(dá)高低與食管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系,以資證明是否可將COX-2表達(dá)高低作為判斷食管鱗癌患者預(yù)后的可靠指標(biāo)。與此同時(shí),我們嘗試通過(guò)RNA沉默技術(shù),阻斷食管鱗癌Ecal09細(xì)胞系COX-2的表達(dá),檢測(cè)COX-2表達(dá)被抑制前后食管鱗癌細(xì)胞的增殖與侵襲能力,以求明確COX-2與食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為之間的關(guān)系,以此為理論基礎(chǔ),進(jìn)一步探討COX-2作為食管鱗癌靶向治療靶點(diǎn)的可能性。第一部分 COX-2在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其與食管鱗癌患者臨床特征之間的相關(guān)性研究目的1.檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌組織和正常食管粘膜組織中COX-2的表達(dá)情況2.統(tǒng)計(jì)分析COX-2的表達(dá)情況與食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理學(xué)特點(diǎn)之間的關(guān)系方法本實(shí)驗(yàn)入組患者共118例,均為在2006年10月～2009年9月間在山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院胸外科接受外科手術(shù)的胸中段食管癌患者。實(shí)驗(yàn)中,成對(duì)留取患者的病理標(biāo)本,包括食管鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁正常食管粘膜組織。本組病例無(wú)手術(shù)前放/化療者。手術(shù)方式為經(jīng)右胸和上腹部二切口食管癌切除、胃食管右胸頂吻合術(shù)(Ivor-Lewis手術(shù))。應(yīng)用免疫組化法和Western blot法檢測(cè)每份標(biāo)本中COX-2的表達(dá)情況,同時(shí)結(jié)合所有入組患者的臨床病理學(xué)資料進(jìn)行回顧性分析。應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。其中,運(yùn)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)的方式來(lái)表示計(jì)量資料,進(jìn)行兩組均數(shù)的比較時(shí),若方差齊,則運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),若方差不齊,則運(yùn)用t’檢驗(yàn)。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)分析COX-2的表達(dá)情況與入組患者臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系。P0.05時(shí),認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果在免疫組化法中,細(xì)胞漿或細(xì)胞膜被染成棕色或黃色顆粒被認(rèn)為是COX-2表達(dá)陽(yáng)性。在入組的所有患者的食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中,有88例(74.6%)入組患者的食管鱗癌標(biāo)本中可發(fā)現(xiàn)COX-2表達(dá)陽(yáng)性�？ǚ綑z驗(yàn)證實(shí),癌旁正常的食管黏膜組織中的COX-2的表達(dá)水平明顯低于癌組織中COX-2的表達(dá)水平(P0.001)。118例患者腫瘤組織中Ⅰ+Ⅱ期和III+IV期患者COX-2陽(yáng)性表達(dá)率分別為54.3%和83.1%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=10.805, P=0.001); T1、T2和T3+T4患者COX-2陽(yáng)性表達(dá)率分別為50.0%、60.0%和82.5%,COX-2表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x 2=8.559,P=0.014)。有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者COX-2表達(dá)率分別為80.7%和56.7%,兩組COX-2表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x 2=6.805,P=0.009)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,COX-2的表達(dá)水平與腫瘤浸潤(rùn)深度(T分期)呈明顯正相關(guān)(P0.05)。通過(guò)卡方檢驗(yàn)可以看出,COX-2表達(dá)情況與病變浸潤(rùn)深度(P=0.014)、病變分化程度(P=0.002)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(P=0.009)及pTNM分期(P=0.001)顯著相關(guān),而與年齡、性別等其他臨床病理學(xué)特點(diǎn)并無(wú)明顯相關(guān)性。簡(jiǎn)單的說(shuō),腫瘤分化程度越差,浸潤(rùn)深度越深,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越多,pTNM分期越晚,則COX-2陽(yáng)性表達(dá)率越高。在本實(shí)驗(yàn)中,66例pT3+T4期患者食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中可檢測(cè)到COX-2陽(yáng)性表達(dá)；43例(89.5%)低分化的食管鱗狀細(xì)胞癌患者標(biāo)本中可檢測(cè)到COX-2陽(yáng)性表達(dá)；,69例(83.1%)術(shù)后病理分期為Ⅲ期和Ⅳ期的患者的食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中可檢測(cè)到COX-2陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)論：1.在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中,COX-2表達(dá)顯著增高。2.COX-2的高表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌病變浸潤(rùn)深度、病變分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及其pTNM分期呈顯著正相關(guān)。3.COX-2的高表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移潛在相關(guān)。第二部分 COX-2與食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析目的：探究COX-2的表達(dá)與經(jīng)手術(shù)完整切除的胸中段食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后之間的關(guān)系。方法：本實(shí)驗(yàn)入組患者共118例,均為在2006年10月～2009年9月間在山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院胸外科接受外科手術(shù)的胸中段食管癌患者。通過(guò)免疫組化法檢測(cè)上述患者食管鱗狀細(xì)胞癌組織中COX-2的表達(dá)情況,并結(jié)合完整的隨訪資料,建立數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,運(yùn)用Kaplan-Meier法及Cox多因素回歸分析計(jì)算患者生存率并檢測(cè)影響生存率的預(yù)后因素。當(dāng)P值0.05時(shí),認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：有、無(wú)COX-2表達(dá)患者的5年生存率為10.22%和50.0%,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。T2患者中,有、無(wú)COX-2表達(dá)者5年生存率分別為16.7%和66.7%,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)；T3+T4患者中,有、無(wú)COX-2表達(dá)組的5年生存率分別為4.5%和21.4%,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.029)。pN0患者中,有、無(wú)COX-2表達(dá)患者5年生存率分別為47.1%和92.3%,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009); pN1+N2患者中,有、無(wú)COX-2表達(dá)組5年生存率分別為1.4%和17.6%,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)。本實(shí)驗(yàn)中ESCC患者總體的3年生存率是36.4%,5年生存率20.3%。中位生存時(shí)間是33.0個(gè)月(95%可信區(qū)間：28.6-49.4個(gè)月)。ESCC組織中未查到COX-2高表達(dá)的患者,其3年和5年生存率分別是73.3%和50%；而ESCC組織中有COX-2高表達(dá)的患者,其3年和5年生存率分別是23.9%和10.2%,中位生存時(shí)間為22.0個(gè)月(95%可信區(qū)間：18.9-32.1個(gè)月)。單因素分析表明,COX-2表達(dá)水平的高低是ESCC患者至關(guān)重要的預(yù)后因素(P=0.004)。ESCC組織中有無(wú)COX-2的高表達(dá),其5年生存率有明顯差異,統(tǒng)計(jì)分析顯示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)單因素分析,我們發(fā)現(xiàn)預(yù)后因素還包括腫瘤分化程度和pTNM分期。分化程度越低,則5年生存率越差,低分化的ESCC患者,5年生存率僅為2.1%,與此同時(shí),高、中分化ESCC患者的5年生存率則為32.9%,兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。pTNM分期越晚,則患者5年生存率越低。Ⅰ+Ⅱ期患者5年生存率為60.0%,而Ⅲ+Ⅳ期患者5年生存率則降至1.2%,兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。同時(shí),分析結(jié)果還顯示,年齡(Age)、性別(Gender)等因素與患者術(shù)后5年生存率并無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。通過(guò)COX多因素回歸分析,我們發(fā)現(xiàn),腫瘤分化程度(P=0.001)、TNM分期(P=0.001)和COX-2表達(dá)水平(P=0.004)均是判斷胸中段食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論：1.腫瘤分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度、pTNM分期及COX-2表達(dá)水平與ESCC患者術(shù)后5年生存率有明顯關(guān)聯(lián)。2.COX-2表達(dá)水平是ESCC患者術(shù)后5年生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。3.COX-2高表達(dá)的胸中段食管鱗癌患者預(yù)后不良,提示COX-2有成為預(yù)測(cè)食管鱗癌患者術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的潛在基因的可能。第三部分 COX-2siRNA體外阻斷COX-2表達(dá)對(duì)食管鱗癌Eca1 09細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究目的：通過(guò)RNA沉默技術(shù),以COX-2 siRNA體外阻斷食管鱗癌Eca109細(xì)胞系COX-2的表達(dá),檢測(cè)COX-2表達(dá)被抑制前后食管鱗癌細(xì)胞的增殖與侵襲能力的差異。方法：具體步驟如下：1.應(yīng)用RT-PCR和Western blot分別從mRNA和蛋白水平檢測(cè)食管鱗癌Eca109細(xì)胞系中COX-2的表達(dá)情況。2.通過(guò)慢病毒攜帶COX-2 siRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌Eca109細(xì)胞系,抑制COX-2的表達(dá),構(gòu)建穩(wěn)定的經(jīng)RT-PCR和Western blot檢驗(yàn)抑制COX-2表達(dá)的Eca109細(xì)胞系。3.應(yīng)用MTT法比較COX-2表達(dá)被抑制前后Eca109細(xì)胞的增殖情況。4.通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)比較COX-2表達(dá)被抑制前后Eca109細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果：1.經(jīng)驗(yàn)證,食管鱗癌細(xì)胞系中存在COX-2高表達(dá)。2.本實(shí)驗(yàn)中,我們應(yīng)用慢病毒攜帶COX-2 siRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌Eca109細(xì)胞系,成功構(gòu)建了經(jīng)RT-PCR和Western blot檢測(cè)COX-2穩(wěn)定低表達(dá)的Eca109細(xì)胞系。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,COX-2表達(dá)被抑制的食管鱗癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力受到明顯抑制。結(jié)論：COX-2明顯影響食管鱗癌細(xì)胞的生物學(xué)行為,與食管鱗癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力顯著相關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.1

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1662411