本文選題：食管鱗狀細胞癌　切入點：COX-2　出處：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景中國是食管鱗狀細胞癌高發(fā)國家,據(jù)估計,我國每年約有25萬例新發(fā)食管癌病例。由于該病起病隱匿,早期一般沒有明顯的自覺癥狀,因此確診時多數(shù)患者都已發(fā)展至中期或晚期。對于早期的食管癌患者,目前臨床上主要采用以手術為主的根治性治療方法,而對于那些已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移等情況的不適宜采取手術治療的中晚期患者,則首推以放化療為主的綜合治療。目前胸中段食管鱗癌的最主要治療措施依然是外科手術,但手術的總體療效仍欠佳,據(jù)文獻報道,食管鱗癌的5年總的生存率僅為30%左右,約一半以上的患者在手術后2年左右出現(xiàn)腫瘤復發(fā),其中局部區(qū)域復發(fā)最常見,以縱隔、鎖骨上、及頸部淋巴結轉(zhuǎn)移為主。盡管近年來食管癌的治療技術已經(jīng)有了較大的進步,但食管癌惡性程度高,疾病進展迅速,易發(fā)生復發(fā)和轉(zhuǎn)移,患者的總體預后仍不容樂觀。所以研究食管鱗癌轉(zhuǎn)移復發(fā)的分子生物學機制,對指導食管鱗癌患者選擇合適的治療方案和改善預后具有非常重要的臨床價值。環(huán)氧合酶(cyclooxygenase, COX),亦可稱之為前列腺素過氧化物合成酶,能調(diào)節(jié)前列腺素的合成,在前列腺素(PG)合成過程中起著至關重要的作用,在其誘導下,花生四烯酸將被轉(zhuǎn)化成類前列腺素(如血栓素等),從而能調(diào)節(jié)機體的生理代謝以及病理代謝過程�，F(xiàn)有的實驗結果證實,細胞中環(huán)氧合酶主要有COX-1和COX-2兩種編碼基因。其中,在正常細胞中可檢測到COX-1基因表達的COX-1,其主要作用是輔助人體正常生理功能的維持。而COX-2則絕少在正常組織細胞中表達,只有在異常的內(nèi)外環(huán)境的刺激下才被誘導性表達。在正常的生理狀態(tài)下,僅僅在腦組織和腎組織中可探及少量的COX-2蛋白。近些年年的研究證實,在人類許多癌前病變和惡性腫瘤中,COX-2均呈現(xiàn)高表達,而且對腫瘤血管生成、細胞周期調(diào)控以及機體免疫功能調(diào)節(jié)均有不同程度的影響,因而在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到非常重要的作用。目前,國內(nèi)外對環(huán)氧合酶與食管鱗狀細胞癌生物學行為的研究仍不多見。本課題應用免疫組化法以及Western blot等技術檢測環(huán)氧合酶COX-2在食管鱗狀細胞癌組織以及正常食管粘膜組織中的表達情況,并結合入組患者的臨床病理資料及完整的隨訪資料,意在探討COX-2表達高低與食管鱗癌患者預后的關系,以資證明是否可將COX-2表達高低作為判斷食管鱗癌患者預后的可靠指標。與此同時,我們嘗試通過RNA沉默技術,阻斷食管鱗癌Ecal09細胞系COX-2的表達,檢測COX-2表達被抑制前后食管鱗癌細胞的增殖與侵襲能力,以求明確COX-2與食管鱗癌細胞生物學行為之間的關系,以此為理論基礎,進一步探討COX-2作為食管鱗癌靶向治療靶點的可能性。第一部分 COX-2在食管鱗癌組織中的表達及其與食管鱗癌患者臨床特征之間的相關性研究目的1.檢測食管鱗狀細胞癌組織和正常食管粘膜組織中COX-2的表達情況2.統(tǒng)計分析COX-2的表達情況與食管鱗狀細胞癌患者臨床病理學特點之間的關系方法本實驗入組患者共118例,均為在2006年10月～2009年9月間在山東大學附屬山東省立醫(yī)院胸外科接受外科手術的胸中段食管癌患者。實驗中,成對留取患者的病理標本,包括食管鱗狀細胞癌組織和癌旁正常食管粘膜組織。本組病例無手術前放/化療者。手術方式為經(jīng)右胸和上腹部二切口食管癌切除、胃食管右胸頂吻合術(Ivor-Lewis手術)。應用免疫組化法和Western blot法檢測每份標本中COX-2的表達情況,同時結合所有入組患者的臨床病理學資料進行回顧性分析。應用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。其中,運用均數(shù)±標準差(x±s)的方式來表示計量資料,進行兩組均數(shù)的比較時,若方差齊,則運用獨立樣本t檢驗,若方差不齊,則運用t’檢驗。應用卡方檢驗分析COX-2的表達情況與入組患者臨床病理學特征之間的關系。P0.05時,認為具有統(tǒng)計學差異。結果在免疫組化法中,細胞漿或細胞膜被染成棕色或黃色顆粒被認為是COX-2表達陽性。在入組的所有患者的食管鱗狀細胞癌標本中,有88例(74.6%)入組患者的食管鱗癌標本中可發(fā)現(xiàn)COX-2表達陽性�？ǚ綑z驗證實,癌旁正常的食管黏膜組織中的COX-2的表達水平明顯低于癌組織中COX-2的表達水平(P0.001)。118例患者腫瘤組織中Ⅰ+Ⅱ期和III+IV期患者COX-2陽性表達率分別為54.3%和83.1%,差異有統(tǒng)計學意義(x2=10.805, P=0.001); T1、T2和T3+T4患者COX-2陽性表達率分別為50.0%、60.0%和82.5%,COX-2表達率差異有統(tǒng)計學意義(x 2=8.559,P=0.014)。有、無淋巴結轉(zhuǎn)移患者COX-2表達率分別為80.7%和56.7%,兩組COX-2表達率差異有統(tǒng)計學意義(x 2=6.805,P=0.009)。Western blot檢測結果顯示,COX-2的表達水平與腫瘤浸潤深度(T分期)呈明顯正相關(P0.05)。通過卡方檢驗可以看出,COX-2表達情況與病變浸潤深度(P=0.014)、病變分化程度(P=0.002)、淋巴結轉(zhuǎn)移情況(P=0.009)及pTNM分期(P=0.001)顯著相關,而與年齡、性別等其他臨床病理學特點并無明顯相關性。簡單的說,腫瘤分化程度越差,浸潤深度越深,淋巴結轉(zhuǎn)移越多,pTNM分期越晚,則COX-2陽性表達率越高。在本實驗中,66例pT3+T4期患者食管鱗狀細胞癌標本中可檢測到COX-2陽性表達；43例(89.5%)低分化的食管鱗狀細胞癌患者標本中可檢測到COX-2陽性表達；,69例(83.1%)術后病理分期為Ⅲ期和Ⅳ期的患者的食管鱗狀細胞癌標本中可檢測到COX-2陽性表達。結論：1.在食管鱗狀細胞癌組織中,COX-2表達顯著增高。2.COX-2的高表達與食管鱗狀細胞癌病變浸潤深度、病變分化程度、淋巴結轉(zhuǎn)移情況及其pTNM分期呈顯著正相關。3.COX-2的高表達與食管鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移潛在相關。第二部分 COX-2與食管鱗狀細胞癌患者預后的相關性分析目的：探究COX-2的表達與經(jīng)手術完整切除的胸中段食管鱗狀細胞癌患者預后之間的關系。方法：本實驗入組患者共118例,均為在2006年10月～2009年9月間在山東大學附屬山東省立醫(yī)院胸外科接受外科手術的胸中段食管癌患者。通過免疫組化法檢測上述患者食管鱗狀細胞癌組織中COX-2的表達情況,并結合完整的隨訪資料,建立數(shù)據(jù)庫。通過SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,運用Kaplan-Meier法及Cox多因素回歸分析計算患者生存率并檢測影響生存率的預后因素。當P值0.05時,認為具有統(tǒng)計學意義。結果：有、無COX-2表達患者的5年生存率為10.22%和50.0%,兩組差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。T2患者中,有、無COX-2表達者5年生存率分別為16.7%和66.7%,兩組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.005)；T3+T4患者中,有、無COX-2表達組的5年生存率分別為4.5%和21.4%,兩組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.029)。pN0患者中,有、無COX-2表達患者5年生存率分別為47.1%和92.3%,兩組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.009); pN1+N2患者中,有、無COX-2表達組5年生存率分別為1.4%和17.6%,兩組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.004)。本實驗中ESCC患者總體的3年生存率是36.4%,5年生存率20.3%。中位生存時間是33.0個月(95%可信區(qū)間：28.6-49.4個月)。ESCC組織中未查到COX-2高表達的患者,其3年和5年生存率分別是73.3%和50%；而ESCC組織中有COX-2高表達的患者,其3年和5年生存率分別是23.9%和10.2%,中位生存時間為22.0個月(95%可信區(qū)間：18.9-32.1個月)。單因素分析表明,COX-2表達水平的高低是ESCC患者至關重要的預后因素(P=0.004)。ESCC組織中有無COX-2的高表達,其5年生存率有明顯差異,統(tǒng)計分析顯示結果具有統(tǒng)計學意義。通過單因素分析,我們發(fā)現(xiàn)預后因素還包括腫瘤分化程度和pTNM分期。分化程度越低,則5年生存率越差,低分化的ESCC患者,5年生存率僅為2.1%,與此同時,高、中分化ESCC患者的5年生存率則為32.9%,兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.001)。pTNM分期越晚,則患者5年生存率越低。Ⅰ+Ⅱ期患者5年生存率為60.0%,而Ⅲ+Ⅳ期患者5年生存率則降至1.2%,兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。同時,分析結果還顯示,年齡(Age)、性別(Gender)等因素與患者術后5年生存率并無顯著關聯(lián)。通過COX多因素回歸分析,我們發(fā)現(xiàn),腫瘤分化程度(P=0.001)、TNM分期(P=0.001)和COX-2表達水平(P=0.004)均是判斷胸中段食管鱗狀細胞癌患者預后的獨立危險因素。結論：1.腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度、pTNM分期及COX-2表達水平與ESCC患者術后5年生存率有明顯關聯(lián)。2.COX-2表達水平是ESCC患者術后5年生存率的獨立危險因素。3.COX-2高表達的胸中段食管鱗癌患者預后不良,提示COX-2有成為預測食管鱗癌患者術后轉(zhuǎn)移復發(fā)的潛在基因的可能。第三部分 COX-2siRNA體外阻斷COX-2表達對食管鱗癌Eca1 09細胞生物學行為影響的研究目的：通過RNA沉默技術,以COX-2 siRNA體外阻斷食管鱗癌Eca109細胞系COX-2的表達,檢測COX-2表達被抑制前后食管鱗癌細胞的增殖與侵襲能力的差異。方法：具體步驟如下：1.應用RT-PCR和Western blot分別從mRNA和蛋白水平檢測食管鱗癌Eca109細胞系中COX-2的表達情況。2.通過慢病毒攜帶COX-2 siRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌Eca109細胞系,抑制COX-2的表達,構建穩(wěn)定的經(jīng)RT-PCR和Western blot檢驗抑制COX-2表達的Eca109細胞系。3.應用MTT法比較COX-2表達被抑制前后Eca109細胞的增殖情況。4.通過Transwell侵襲實驗比較COX-2表達被抑制前后Eca109細胞的侵襲能力。結果：1.經(jīng)驗證,食管鱗癌細胞系中存在COX-2高表達。2.本實驗中,我們應用慢病毒攜帶COX-2 siRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌Eca109細胞系,成功構建了經(jīng)RT-PCR和Western blot檢測COX-2穩(wěn)定低表達的Eca109細胞系。3.實驗結果顯示,COX-2表達被抑制的食管鱗癌細胞的增殖和侵襲能力受到明顯抑制。結論：COX-2明顯影響食管鱗癌細胞的生物學行為,與食管鱗癌細胞的增殖及侵襲能力顯著相關。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1

【引證文獻】

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1 史文琦;在體磁共振氫質(zhì)子波譜聯(lián)合環(huán)氧合酶-2評價人腦膠質(zhì)瘤生物學行為[D];山東大學;2017年

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本文編號：1662411