本文選題：半胱氨酸蘿卜硫素　切入點(diǎn)：ERK1/2　出處：《首都醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：背景和目的:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是一種常見(jiàn)的惡性程度極高的腦部腫瘤,標(biāo)準(zhǔn)治療方案為手術(shù)配合放射性或化學(xué)療法。因膠質(zhì)母細(xì)胞瘤經(jīng)常對(duì)常用化療藥物替莫唑胺(temozolomide,TMZ)產(chǎn)生耐藥性,使得治療后的患者存活期僅為15個(gè)月左右。因此,尋找一種高效低毒的化療藥物顯得尤為重要。研究顯示,十字花科植物能有效防治癌癥的發(fā)生發(fā)展,蘿卜硫素(Sulforaphane,SFN)是其天然提取成分。我們的前期結(jié)果表明SFN通過(guò)持續(xù)活化ERK1/2抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵潤(rùn),而半胱氨酸蘿卜硫素(Sulforaphane-cysteine,SFN-Cys)是SFN類似物,也是SFN在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物,具有更長(zhǎng)的半衰期,可能能更有效的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)將研究SFN-Cys誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U373MG和U87MG細(xì)胞凋亡的機(jī)制,為在臨床上治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者提供理論支持。方法和結(jié)果:細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示,SFN-Cys抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U373MG和U87MG細(xì)胞增殖遵循劑量依賴關(guān)系。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),SFN-Cys改變細(xì)胞形態(tài),在SFN-Cys處理濃度為30μmol/L時(shí),U373MG和U87MG細(xì)胞除了形態(tài)發(fā)生變化外,細(xì)胞數(shù)量也開(kāi)始明顯降低。我們用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了SFN-Cys對(duì)細(xì)胞凋亡的影響:SFN-Cys誘導(dǎo)U373MG和U87MG細(xì)胞凋亡遵循劑量依賴關(guān)系。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示,SFN-Cys活化ERK1/2遵循劑量依賴關(guān)系,上調(diào)Bax/Bcl-2比例和活化Caspase-3,而這些結(jié)果被ERK1/2抑制劑PD98059逆轉(zhuǎn)。JC-1線粒體膜電位實(shí)驗(yàn)顯示,SFN-Cys降低U373MG和U87MG細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP),而PD98059逆轉(zhuǎn)了SFN-Cys誘導(dǎo)的MMP降低。結(jié)論:SFN-Cys活化ERK1/2并通過(guò)ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào)Bax/Bcl-2比例、活化Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白,最終誘導(dǎo)U373MG和U87MG細(xì)胞內(nèi)源途徑凋亡。這些發(fā)現(xiàn)預(yù)示SFN-Cys可能是一種優(yōu)于SFN的抗人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤藥物,尤其在耐藥腫瘤中表現(xiàn)出巨大潛力。背景和目的:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤具有極強(qiáng)的侵襲能力,手術(shù)與放射性或化學(xué)治療效果并未取得令人滿意的結(jié)果,治療后的患者存活期僅為15個(gè)月左右。我們的前期研究成果表明,十字花科植物提取成分蘿卜硫素(Sulforaphane-cysteine,SFN-Cys)可以抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和前列腺癌細(xì)胞侵潤(rùn),這為治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤帶來(lái)新的希望。而SFN類似物半胱氨酸蘿卜硫素(Sulforaphane-cysteine,SFN-Cys)具有更突出的抗癌特點(diǎn),可以穿過(guò)血腦屏障并有更長(zhǎng)的半衰期。因此,本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究SFN-Cys抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U373MG和U87MG細(xì)胞遷移和侵潤(rùn)的機(jī)制,為臨床上治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者提供新藥。方法和結(jié)果:細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,SFN-Cys活化ERK1/2抑制SFN-Cys抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U373MG和U87MG細(xì)胞遷移和侵潤(rùn),并遵循劑量依賴關(guān)系。Western blot顯示,SFN-Cys活化ERK1/2遵循劑量依賴關(guān)系,下調(diào)α-tubulin和Stathmin-1蛋白表達(dá),上調(diào)p Stathmin-1(Ser 25)蛋白表達(dá),而ERK1/2抑制劑可以逆轉(zhuǎn)SFN-Cys對(duì)α-tubulin,Stathmin-1和p Stathmin-1(Ser 25)蛋白表達(dá)的調(diào)控。免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)表明,SFN-Cys下調(diào)α-tubulin,破壞微管結(jié)構(gòu)使其變?yōu)椤傍B(niǎo)巢”狀。激光共聚焦顯微鏡觀察到,SFN-Cys雖下調(diào)Stathmin-1蛋白表達(dá),但沒(méi)有影響Stathmin-1與α-tubulin的結(jié)合能力。結(jié)論:SFN-Cys活化ERK1/2下調(diào)α-tubulin、Stathmin-1,上調(diào)p Stathmin-1(Ser 25)蛋白水平,最終抑制U373MG和U87MG細(xì)胞遷移和侵潤(rùn)。綜上,SFN-Cys作為一種高效低毒的藥物,將為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者帶來(lái)新的希望。
[Abstract]:Background and objective: glioblastoma is a common malignant brain tumor, the standard treatment for radioactive or chemical therapy with surgery for glioblastoma. Often the commonly used chemotherapy drug temozolomide (temozolomide, TMZ) resistance, so that after the treatment of patients with survival was only 15 a month or so. Therefore, finding an effective chemotherapy drug is particularly important. Research shows that cruciferous plants can effectively prevent the development of cancer, sulforaphane (Sulforaphane, SFN) is the extraction of natural ingredients. Our early results show that the SFN through the persistent activation of ERK1/2 inhibited glioblastoma cell invasion run, and cysteine sulforaphen (Sulforaphane-cysteine, SFN-Cys) SFN analogues is SFN metabolites in the human body, has a longer half-life, could effectively induce cell apoptosis. The mechanism study of SFN-Cys induced U373MG glioma cells and the apoptosis of U87MG cells, for the treatment of glioblastoma patients in the clinic to provide theoretical support. Methods and results: cell proliferation assays demonstrated SFN-Cys inhibited the proliferation of U373MG glioma cells and U87MG cells following the dose dependent relationship. Cell morphology observation, cell morphology the change in SFN-Cys, SFN-Cys concentration is 30 mol/L, U373MG and U87MG cells in addition to morphological changes, the number of cells began to decrease. We use flow cytometry to further validate the effect of SFN-Cys on apoptosis induced by SFN-Cys: U373MG and U87MG cell apoptosis following the dose dependent relation of.Western blot experiment, SFN-Cys activation ERK1/2 follow the dose dependent up regulation of Bax/Bcl-2 ratio and activation of Caspase-3, and these results by ERK1/2 inhibitor PD98059 reversed the.JC-1 line According to the mitochondrial membrane potential and mitochondrial U373MG SFN-Cys experiment, reduce the membrane potential of U87MG cells (mitochondrial membrane potential, MMP), while PD98059 reversed the SFN-Cys induced decrease of MMP. Conclusion: the activation of SFN-Cys and ERK1/2 through ERK1/2 signal transduction pathway in the up regulation of Bax/Bcl-2 ratio, activation of Caspase-3 and other apoptosis related proteins, U373MG and U87MG cells induce endogenous pathway apoptosis. These findings indicate SFN-Cys may be glioblastoma against a drug is better than SFN, especially shows great potential in drug resistant tumors. Background and purpose: glioblastoma cell tumor with strong invasiveness, surgery and radioactive or chemical treatment did not achieve satisfactory results after treatment. Patient survival was only 15 months. The previous research results we show that cruciferous plant extract sulforaphane (Sulforaphane-cysteine, SFN-Cy S) can inhibit glioblastoma cells and prostate cancer cell invasion, which brings new hope for the treatment of glioblastoma. SFN analogs of cysteine sulforaphen (Sulforaphane-cysteine, SFN-Cys) with anticancer features more prominent, can cross the blood-brain barrier and has a long half-life. Therefore, the mechanism of the further study of SFN-Cys inhibition of U373MG glioma cells and U87MG cell migration and invasion, provide new drugs for the clinical treatment of patients with glioblastoma. Methods and results: display cell scratch assay and Transwell invasion assay, SFN-Cys activated ERK1/2 inhibited SFN-Cys inhibition of U373MG glioma cells and U87MG cell migration and invasion, and follow the dose dependent activation of SFN-Cys ERK1/2.Western blot display, follow the dose dependent expression of -tubulin alpha and Stathmin-1 protein, up-regulated P protein expression Stathmin-1 (Ser 25) Da, ERK1/2 inhibitors can reverse the SFN-Cys of -tubulin Stathmin-1 and P alpha, Stathmin-1 (Ser 25) protein expression. Immunofluorescence staining experiments showed that down-regulation of SFN-Cys alpha -tubulin, which becomes the "bird's nest" - destroy the microtubule structure. Laser confocal microscopy, SFN-Cys, Stathmin-1 protein expression was down regulated, but no with the ability to influence Stathmin-1 and alpha -tubulin. Conclusion: the activation of SFN-Cys ERK1/2 down-regulation of alpha -tubulin, Stathmin-1, Stathmin-1 (25 Ser) up-regulated P protein levels, ultimately inhibit U373MG and U87MG cell migration and invasion. In summary, SFN-Cys as a drug with high efficiency and low toxicity, will bring new hope to patients with glioblastoma.

【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.41

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本文編號(hào)：1659882