本文選題：HP1γ　切入點：結直腸癌　出處：《南京大學》2016年博士論文

【摘要】：結直腸癌(CRC)是世界范圍內常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率及死亡率均居惡性腫瘤的第3位。在我國,結直腸癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第3位,死亡率居惡性腫瘤的第5位。隨著人民生活水平的提高和生活方式的轉變,其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢,極大的威脅著人類健康,其主要原因在于人們對結直腸癌發(fā)病分子機制方面的研究一直沒有取得重大的突破。因此,深入研究結直腸癌發(fā)病的分子機制,對結直腸癌早期診斷、臨床治療及預后都有著重要的意義。異染色質蛋白1-g(Heterochromatin protein 1-g,HP1γ)屬于異染色質蛋白家族成員,由CBX3(Chromobox homolog 3)基因編碼。作為染色質的特殊形式,HP1γ在很多生物學過程中發(fā)揮重要作用,例如異染色質的形成與基因沉默、DNA損傷修復、RNA剪接、轉錄激活、干細胞分化以及體細胞的重編程過程等。鑒于其分布廣泛性,以及在基因調節(jié)中的不同作用,HP1γ很可能密切地參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。然而,HP1γ在結直腸癌中的作用機制尚不明確,有待深入研究闡明。為了解HP1γ在結直腸癌中的表達情況,我們首先在Oncomine數據庫中對HP1γ表達情況進行了初步分析,分析結果表明HP1γ在結直腸癌組織中表達上調。為了驗證這一結果,我們制備了包含180例結直腸癌標本及配對的癌旁正常對照的組織芯片,隨后利用免疫組織化學染色檢測了HP1γ蛋白在180例結直腸癌組織中的表達情況,并詳細分析了HP1γ的表達與患者性別、年齡、腫瘤尺寸、位置、分化程度、轉移和TNM分期等臨床病理參數之間的關系。結果顯示在結直腸癌組織中HP1γ蛋白表達水平顯著高于正常組織(n=178,P0.001),并且發(fā)現HP1γ的表達與腫瘤分化程度呈顯著負相關(P0.05)。隨后,我們運用Kaplan-Meier法分析了180例結直腸癌患者的生存數據,并用Log-Rank檢驗分析比較了HP1γ高表達和低表達二者之間生存曲線的差異。結果顯示,HP1γ的表達水平與結直腸癌患者的生存率之間呈負相關,在統(tǒng)計學上有非常顯著的差異(P=0.001)。另外,在38例新鮮結直腸癌組織標本中,我們通過Western blot和Real-time PCR實驗再次證實HP1γ蛋白和mRNA表達水平顯著高于其配對的癌旁正常組織(P0.01)。鑒于HP1γ在結直腸癌中的表達情況,我們推測HP1γ在結直腸癌中可能扮演促癌基因的角色。為了驗證這一推測,我們對HP1γ在結直腸癌細胞中的生物學功能進行了深入詳細的研究。我們通過CCK-8、EdU、平板克隆形成、Transwell、劃痕愈合、流式細胞周期與凋亡、裸鼠皮下成瘤實驗分析檢測了HP1γ表達沉默后對結直腸癌細胞增殖、克隆形成、轉移、細胞周期與凋亡、體內成瘤能力的影響。結果表明,HP1γ表達沉默后結直腸癌細胞增殖、克隆形成及體內成瘤能力被抑制,但對轉移能力沒有顯著影響。而且,流式細胞周期分析結果也顯示HP1γ表達沉默后會導致結直腸癌細胞被阻滯在G1期,這暗示著HP1γ可能通過細胞周期相關的蛋白來調節(jié)細胞增殖,也進一步表明HP1γ在結直腸癌中扮演促癌基因的角色,暗示著HP1γ有可能成為將來治療結直腸癌的一個新的靶點。隨后,通過Real-time PCR實驗我們對HP1γ表達沉默后細胞增殖和周期調控相關的一些關鍵基因進行了檢測,結果發(fā)現HP1γ表達沉默后會導致p21~(Waf1/Cip1) mRNA(P0.01)和蛋白水平顯著上調。p21~(Waf1/Cip1)是一個抑癌基因,是細胞周期G1/S轉換的負調控因子。為了弄清HP1γ是否結合在p21~(Waf1/Cip1)基因啟動子上來調節(jié)其表達,我們利用染色質免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)技術分析了HP1γ在p21~(Waf1/Cip1)基因啟動子上的結合情況。我們在p21~(Waf1/Cip1)基因啟動子上不同位點設計引物進行Real-time PCR分析,結果表明,HP1γ在p21~(Waf1/Cip1)基因啟動子-297~-191處結合最強,但在更遠的啟動子區(qū)域如-2596~-2414和-2069~-1906處則沒有結合。此外,當HP1γ表達沉默以后HP1γ在p21~(Waf1/Cip1)基因啟動子上的結合顯著減弱(P0.01)。因此,HP1γ可以結合在p21~(Waf1/Cip1)基因啟動子上來調節(jié)其表達,為典型的負調控方式。由于H3K9me2/3(組蛋白H3第9位賴氨酸2/3甲基化)是HP1家族在染色質上最主要的結合位點,我們想確定HP1γ是否會影響p21~(Waf1/Cip1)基因啟動子上組蛋白標記H3K9me2/3水平。我們利用ChIP實驗檢測了p21~(Waf1/Cip1)基因啟動子上H3K9me2/3修飾情況。結果表明,p21~(Waf1/Cip1)基因啟動子上存在H3K9me2/3修飾;并且當HP1γ表達沉默以后,p21~(Waf1/Cip1)基因啟動子處的H3K9me2/3水平均會顯著降低(P0.01),其中H3K9me3水平降低更為顯著。這個結果表明HP1γ調控p21~(Waf1/Cip1)基因表達涉及到組蛋白甲基化修飾。微小RNA(miRNA)在細胞生命活動中具有廣泛的調節(jié)功能,自從被發(fā)現以來已經成為生命科學的研究熱點。我們通過TargetScan,PicTar和mi Randa在線miRNA-靶基因預測網站篩選出miR-30a(Hsa-miR-30a-5p)可能會靶向結合HP1γ基因。利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)我們證明了miR-30a可直接結合在HP1γmRNA的3’-UTR上并抑制熒光素酶的表達。在結直腸癌細胞HCT116和SW620中miR-30a過表達顯著抑制了HP1γ蛋白水平的表達,但對HP1γmRNA水平無顯著影響。并且在38例新鮮結直腸癌組織標本中mi R-30a和HP1γ蛋白表達水平呈顯著負相關(R=-0.5981,P0.01),提示著miR-30a在結直腸癌中可以抑制HP1γ蛋白表達。隨后我們在體外、體內對miR-30a在結直腸癌中的生物學功能展開了研究,結果表明miR-30a可以通過下調HP1γ的表達來抑制結直腸癌細胞增殖。除此之外,miR-30a還可以抑制HCT116細胞克隆形成、阻滯細胞周期過程及促進細胞凋亡,在結直腸癌細胞中扮演著抑癌基因的角色。本研究將結直腸癌組織中HP1γ蛋白水平的上調與miR-30a下調聯系起來,通過調控p21~(Waf1/Cip1)基因轉錄來促進結直腸癌細胞增殖。miR-30a/HP1γ/p21~(Waf1/Cip1)級聯機制為結直腸癌發(fā)病分子機制提供了新的解釋,豐富了結直腸癌發(fā)病的分子機制,對揭示其發(fā)病的精細分子機制、開發(fā)有效的治療措施及判斷預后,進一步提高我國結直腸癌的治療水平具有重要的臨床價值和社會效益。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.3

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本文編號：1659186