本文選題：結(jié)直腸癌　切入點：PGRN　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是目前常見的胃腸道惡性腫瘤,占所有惡性腫瘤的10%-15%,其病死率在全球所有腫瘤中高居第三位。近年來,隨著科技的不斷發(fā)展,手術(shù)、化療、放療等傳統(tǒng)的腫瘤治療手段得到了很大的改進(jìn),分子靶向治療及生物治療等新興治療手段也取得了進(jìn)一步的發(fā)展,CRC患者的總生存率得到了一定程度的改善,但是,進(jìn)展期CRC患者的預(yù)后仍不理想。因此,尋找有效靶點抑制CRC進(jìn)展仍面臨巨大挑戰(zhàn)。腫瘤進(jìn)展是腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境相互作用、相互促進(jìn)的過程,腫瘤血管生成和間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化是腫瘤微環(huán)境中重要的促腫瘤因素。腫瘤細(xì)胞通過與間質(zhì)細(xì)胞的直接接觸,或者通過分泌血管內(nèi)皮生長因子-A (VEGF-A)、轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-p)、血管內(nèi)皮生長因子-C (VEGF-C)等細(xì)胞因子,激活血管內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)成纖維細(xì)胞內(nèi)信號通路,調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖、遷移能力,誘導(dǎo)間質(zhì)成纖維細(xì)胞高表達(dá)成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)、平滑肌肌動蛋白α(α-SMA),從而促進(jìn)腫瘤血管生成和間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化。腫瘤血管既通過輸送營養(yǎng)物質(zhì)滿足了腫瘤細(xì)胞生長的需要,又通過血液循環(huán)為腫瘤細(xì)胞的播散和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件；活化的成纖維細(xì)胞通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)等過程促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲、耐藥等惡性生物學(xué)特性。因此,尋找能抑制腫瘤細(xì)胞生長、血管生成和間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化的靶點,將為CRC患者提供更有效的治療手段。顆粒蛋白前體(Progranulin, PGRN)基因位于人17號染色體,編碼區(qū)由12個外顯子(Ⅰ-Ⅻ)構(gòu)成。PGRN蛋白分子量為68.5kDa,經(jīng)糖基化修飾后分子量為90kDa,是由7.5個富含絲氨酸的串聯(lián)重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域組成的分泌性糖蛋白,廣泛表達(dá)于免疫細(xì)胞、神經(jīng)元、上皮細(xì)胞及軟骨細(xì)胞等,在介導(dǎo)創(chuàng)傷愈合、抑制神經(jīng)退行性變及軟骨形成方面發(fā)揮了重要作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)PGRN在乳腺癌、卵巢癌、肝癌等腫瘤的增殖、耐藥、遷移、侵襲中發(fā)揮了重要的作用,但其在CRC增殖和血管生成中的作用尚未見報道。除了對腫瘤細(xì)胞的作用,有研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞來源的PGRN可以激活小鼠乳腺間質(zhì)成纖維細(xì)胞,促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長：在小鼠皮膚損傷修復(fù)過程中,損傷局部高濃度PGRN的聚集,促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的增殖和遷移,參與組織的修復(fù)和重塑。然而,人CRC細(xì)胞來源的PGRN是否可以促進(jìn)間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化尚不清楚。腫瘤壞死因子受體2(tumor necrosis factor receptor 2, TNFR2)是腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族成員,分為可溶型(sTNFR2)和膜結(jié)合型(mTNFR2),在多種腫瘤中高表達(dá),并參與了腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程。盡管研究發(fā)現(xiàn)病人血液中sTNFR2的水平高低與患CRC的風(fēng)險密切相關(guān),但CRC組織中TNFR2的臨床相關(guān)性尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)PGRN可以通過TNFR2抑制腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor a, TNF-a)介導(dǎo)的急性肺損傷中中性粒細(xì)胞的活化和小鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的炎癥反應(yīng)。但是,PGRN是否可以通過TNFR2促進(jìn)腫瘤進(jìn)展尚不清楚,PGRN對TNFR2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用亦未見報道。研究目的明確PGRN與CRC患者臨床參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性；檢測PGRN對CRC增殖和血管生成的作用；檢測CRC中PGRN對間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化的作用；明確PGRN發(fā)揮以上作用的分子機(jī)制；明確TNFR2與CRC患者臨床參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性,并進(jìn)一步研究PGRN對TNFR2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,以期為CRC的治療提供新的靶點。研究方法1.免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)檢測PGRN在CRC組織和正常結(jié)直腸組織中的表達(dá),并進(jìn)一步分析CRC組織中PGRN表達(dá)與患者臨床參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系；RT-PCR, Western blot, ELISA檢測PGRN在人CRC細(xì)胞系和人正常腸上皮細(xì)胞系中的表達(dá)。2.用p-GPU6/GFP/Neo/PGRN質(zhì)�；蚩蛰d體轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞SW480、SW1116和HT29,獲得干擾PGRN表達(dá)的CRC細(xì)胞株SW480-PGRN-sh、SW1116-PGRN-sh、 HT29-PGRN-sh及對照細(xì)胞株SW480-NC-sh、SW1116-NC-sh、HT29-NC-sh;用pEZ-M61/GFP/PGRN質(zhì)�；蚩蛰d體轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞SW480、SW1116,獲得過表達(dá)PGRN的細(xì)胞株SW480-PGRN-vector、SW1116-PGRN-vector及對照細(xì)胞株SW480-NC-vector、SW1116-NC-vector。RT-PCR、Western blot確定轉(zhuǎn)染效率。3.IHC檢測增殖指標(biāo)Ki67在CRC組織的表達(dá),并分析與PGRN的相關(guān)性；上調(diào)/下調(diào)SW1116細(xì)胞PGRN表達(dá)后,RT-PCR、Western blot檢測Ki67、抗凋亡指標(biāo)Bcl-2表達(dá)變化；MTT檢測細(xì)胞生長變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡變化。下調(diào)HT29細(xì)胞PGRN表達(dá)后,MTT檢測細(xì)胞生長變化。檢測PGRN重組蛋白對SW1116細(xì)胞Ki67表達(dá)的影響。4.IHC檢測VEGF-A、血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記分子CD34在CRC中的表達(dá),并分析PGRN與VEGF-A表達(dá)和微血管密度(MVD)的相關(guān)性；上/下調(diào)SW1116細(xì)胞PGRN表達(dá)后,檢測VEGF-A、成纖維細(xì)胞生長因子1 (FGF1)、VEGF-C表達(dá)的變化；檢測PGRN重組蛋白對SW1116細(xì)胞VEGF-A表達(dá)的影響；檢測SW1116-PGRN-vector細(xì)胞條件培養(yǎng)基或PGRN重組蛋白對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC) Ki67. VEGF-A表達(dá)及增殖、遷移、成管能力的影響。5. Western blot檢測PGRN對SW1116細(xì)胞細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinases, ERK)、蛋白激酶B (protein kinase B,PKB or AKT)、P38磷酸化水平的影響,并篩選出PGRN下游通路靶點ERK、AKT;加入ERK或AKT通路阻滯劑后,檢測PGRN誘導(dǎo)的Ki67、VEGF-A表達(dá)的變化,以明確PGRN是否通過ERK、AKT通路調(diào)節(jié)Ki67、VEGF-A的表達(dá)；加入TNFR2中和抗體,檢測PGRN誘導(dǎo)的SW1116細(xì)胞中Ki67、VEGF-A、p-ERK、p-AKT的變化,以明確TNFR2在PGRN對CRC細(xì)胞Ki67、VEGF-A表達(dá)調(diào)節(jié)中的作用。加入TNFR2中和抗體,檢測SW1116-PGRN-vector細(xì)胞條件培養(yǎng)基或PGRN重組蛋白誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞Ki67、VEGF-A、p-ERK、p-AKT表達(dá)的變化,以明確TNFR2在PGRN誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞血管形成能力中的作用。6.將CRC細(xì)胞SW480、SW1116與結(jié)腸間質(zhì)成纖維細(xì)胞CCD-18Co同時均勻鋪種于六孔板中,設(shè)固定時間點觀察細(xì)胞貼壁情況,比較貼壁時間的差異；將SW480或SW1116細(xì)胞與CCD-18Co細(xì)胞共培養(yǎng),根據(jù)貼壁時間的差異分離獲得成纖維細(xì)胞,分別命名為CCD-18Co/SW480細(xì)胞或CCD-18Co/SW1116細(xì)胞,通過檢測上皮標(biāo)記E-cadherin和成纖維細(xì)胞活化標(biāo)記α-SMA的表達(dá)驗證分離后成纖維細(xì)胞的純度。7.IHC染色并分析CRC細(xì)胞中PGRN表達(dá)與間質(zhì)中α-SMA表達(dá)的相關(guān)性：將SW480-NC-sh、SW480-PGRN-sh分別與CCD-18Co細(xì)胞共培養(yǎng),分離后檢測CCD-18Co、CCD-18Co/SW480-NC-sh及CCD-18Co/SW480-PGRN-sh細(xì)胞中Ki67、FAP、 α-SMA的表達(dá)差異；MTT檢測增殖能力變化；Transwell小室檢測遷移能力變化；凝膠收縮實驗檢測收縮能力變化。同樣方法檢測SW1116細(xì)胞中PGRN變化對共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中Ki67、FAP、α-SMA表達(dá)的影響。PGRN重組蛋白處理CCD-18Co細(xì)胞,進(jìn)一步觀察PGRN對成纖維細(xì)胞增殖能力、遷移能力、收縮能力的影響。8.分別與SW480-NC-sh、SW480-PGRN-sh細(xì)胞共培養(yǎng)后,檢測CCD-18Cα、 CCD-18Co/sW480-NC-sh、CCD-18Co/SW480-PGRN-sh細(xì)胞中ERK、AKT、P38、JNK磷酸化水平的差異；PGRN重組蛋白處理后,檢測CCD-18Co細(xì)胞ERK、AKT、 P38、JNK磷酸化水平變化,篩選出PGRN下游通路靶點ERK、AKT;加入ERK或AKT通路阻滯劑,檢測PGRN重組蛋白誘導(dǎo)的CCD-18Co細(xì)胞Ki67、FAP、 α-SMA蛋白表達(dá)變化,明確PGRN是否通過ERK、AKT通路調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞Ki67、TAP、α-SMA蛋白表達(dá)變化。加入TNFR2中和抗體后,檢測PGRN重組蛋白誘導(dǎo)的CCD-18Co細(xì)胞中Ki67、FAP、α-SMA、p-ERK、p-AKT表達(dá)及細(xì)胞增殖、遷移、收縮能力的變化。9.IHC檢測CRC組織中TNFR2的表達(dá),分析其與CRC患者臨床參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性,并分析與PGRN表達(dá)的相關(guān)性；通過轉(zhuǎn)染上調(diào)／下調(diào)SW480細(xì)胞、SW1116細(xì)胞PGRN的表達(dá),檢測TNFR2表達(dá)的變化：用PGRN重組蛋白處理SW480細(xì)胞、SW1116細(xì)胞,檢測TNFR2表達(dá)的變化；上調(diào)PGRN表達(dá)或PGRN重組蛋白處理后,檢測SW480細(xì)胞、SW1116細(xì)胞p-ERK、p-AKT、p-P38的變化；加入ERK阻滯劑U0126或AKT阻滯劑LY294002后,檢測SW480細(xì)胞、SW1116細(xì)胞TNFR2表達(dá)的變化。研究結(jié)果1. PGRN在CRC中高表達(dá),并與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)IHC檢測顯示PGRN在CRC組織(77例)中的表達(dá)明顯強(qiáng)于正常結(jié)直腸組織(20例)中的表達(dá)(P=0.000),且PGRN表達(dá)與臨床分期進(jìn)展(P=0.021)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.046)呈正相關(guān),與患者無病生存期(DFS)呈明顯負(fù)相關(guān)(P=0.042); RT-PCR、Western blot ELISA檢測結(jié)果均顯示：CRC細(xì)胞系(SW480、 SW1116、HT29)中PGRN的表達(dá)均明顯強(qiáng)于正常腸上皮細(xì)胞系(FHC)中的表達(dá)。2. PGRN促進(jìn)了CRC增殖IHC檢測顯示：CRC組織中PGRN表達(dá)與Ki67的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(P=0.002)；上調(diào)SW1116細(xì)胞PGRN表達(dá)后,Ki67蛋白表達(dá)明顯升高,細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)；下調(diào)SW1116細(xì)胞PGRN表達(dá)后,Ki67 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低,Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯降低,細(xì)胞增殖能力明顯降低；下調(diào)HT29細(xì)胞PGRN表達(dá)后,細(xì)胞增殖能力亦明顯降低；另外,PGRN重組蛋白促進(jìn)了SW1116細(xì)胞Ki67蛋白表達(dá)。3. PGRN促進(jìn)了CRC血管生成IHC檢測顯示：CRC組織中PGRN表達(dá)與VEGF-A表達(dá)(P=0.001)、MVD(P=0.006)呈明顯正相關(guān)；上調(diào)SW1116細(xì)胞PGRN表達(dá)后,VEGF-A、 VEGF-C、FGF1蛋白表達(dá)明顯升高,ELISA檢測顯示上清中VEGF-A表達(dá)亦明顯升高；下調(diào)SW1116細(xì)胞PGRN表達(dá)后,VEGF-A、VEGF-C、FGF1蛋白表達(dá)明顯降低,ELISA檢測顯示上清中VEGF-A表達(dá)亦明顯降低；PGRN重組蛋白亦明顯促進(jìn)了SW1116細(xì)胞VEGF-A蛋白的表達(dá)；另外,SW1116-PGRN-vector細(xì)胞條件培養(yǎng)基和PGRN重組蛋白均明顯促進(jìn)了HUVEC細(xì)胞Ki67、VEGF-A的蛋白表達(dá),增強(qiáng)了HUVEC細(xì)胞增殖、遷移、成管能力。4. PGRN通過TNFR2/AKT和ERK通路促進(jìn)了CRC細(xì)胞Ki67、VEGF-A的表達(dá)和HUVEC的血管形成能力上調(diào)PGRN表達(dá)或用PGRN重組蛋白處理后,SW1116細(xì)胞ERK、AKT磷酸化水平明顯升高；加入ERK阻滯劑U0126或AKT阻滯劑LY294002后,PGRN誘導(dǎo)的Ki67. VEGF-A表達(dá)被明顯抑制；加入TNFR2中和抗體,PGRN誘導(dǎo)的Ki67、VEGF-A、p-AKT被明顯抑制；加入TNFR2中和抗體,SW1116-PGRN-vector細(xì)胞條件培養(yǎng)基或PGRN重組蛋白誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞中Ki67、EGF-A、p-AKT的表達(dá)均被明顯抑制。5.共培養(yǎng)后成纖維細(xì)胞分離及純度鑒定鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：CCD-18C。細(xì)胞在30分鐘時已貼壁,SW480、SW1116細(xì)胞在90分鐘時才開始貼壁,貼壁時間差異明顯；與SW480細(xì)胞共培養(yǎng),分離后得到成纖維細(xì)胞CCD-18Co/sw480并進(jìn)行純度驗證：免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)檢測發(fā)現(xiàn)上皮標(biāo)記分子E-cadherin在SW480細(xì)胞上染色明顯,而CCD-18Co/sw480細(xì)胞成纖維細(xì)胞活化標(biāo)記分子a-SMA染色明顯,未見E-cadherin顯色；Western blot檢測同樣發(fā)現(xiàn)SW480細(xì)胞E-cadherin表達(dá)明顯,未檢測到a-SMA表達(dá),而CCD-18Co/sw480細(xì)胞a-SMA表達(dá)明顯,未檢測到E-cadherin表達(dá)。6.CRC細(xì)胞來源的PGRN促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的增殖、遷移、收縮能力IHC結(jié)果顯示：a-SMA在CRC間質(zhì)中染色明顯,CRC細(xì)胞中PGRN表達(dá)與間質(zhì)中a-SMA表達(dá)呈明顯正相關(guān)(P=0.013)。與改變PGRN表達(dá)的SW480細(xì)胞共培養(yǎng)后,相對于CCD-18C0細(xì)胞,共培養(yǎng)后的CCD-18CO/sw480-NC-sh細(xì)胞Ki67、FAP、α-SMA蛋白表達(dá)均明顯升高；細(xì)胞增殖、收縮能力亦明顯增強(qiáng)。相對于CCD-18Co/sw480-NC-sh細(xì)胞,CCD-18Co/sw480-PGRN-sh細(xì)胞Ki67、FAP、α-SMA蛋白表達(dá)均明顯降低；細(xì)胞增殖、遷移、收縮能力亦明顯減弱。與改變PGRN表達(dá)的SW1116細(xì)胞共培養(yǎng)后,相對于CCD-18C。細(xì)胞,共培養(yǎng)后的CCD-18Co/SW1116-NC-sh細(xì)胞Ki67、FAP、α-SMA蛋白表達(dá)均明顯升高；相對于CCD-18Co/SW1116-NC-sh細(xì)胞,CCD-18Co/SW1116-PGRN-sh細(xì)胞Ki67、FAP、α-SMA蛋白表達(dá)均明顯降低。PGRN重組蛋白處理CCD-18Co細(xì)胞后,Ki67、FAP、α-SMA蛋白表達(dá)亦明顯升高；細(xì)胞增殖、遷移、收縮能力亦明顯增強(qiáng)。7. TNFR2/AKT和ERK信號通路參與了PGRN對成纖維細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)與CCD-18Co細(xì)胞相比,共培養(yǎng)后的CCD-18CO/sW480-NC-sh細(xì)胞ERK. AKT磷酸化水平明顯升高；與CCD-18Co/sw480-NC-sh細(xì)胞相比,CCD-18Co/sw480-PGRN-sh細(xì)胞ERK、AKT磷酸化水平明顯降低。PGRN重組蛋白處理CCD-18Co細(xì)胞后,ERK、AKT磷酸化水平明顯升高；分別加入ERK阻滯劑U0126或AKT阻滯劑LY294002后,PGRN重組蛋白誘導(dǎo)的CCD-18Co細(xì)胞中Ki67、FAP蛋白的上調(diào)被明顯抑制,但a-SMA蛋白表達(dá)無變化；加入TNFR2中和抗體后,PGRN重組蛋白誘導(dǎo)的CCD-18Co細(xì)胞中Ki67、FAP、α-SMA、p-AKT的上調(diào)均被明顯抑制；細(xì)胞增殖、遷移、收縮能力的增強(qiáng)亦被明顯抑制。8. TNFR2在CRC中高表達(dá),并與患者年齡、腫瘤大小及不良預(yù)后密切相關(guān)IHC檢測顯示CRC組織中TNFR2表達(dá)明顯高于正常結(jié)直腸組織(P=0.000),CRC組織中TNFR2與患者年齡(P=0.011)、腫瘤大小(P=0.022)和無病生存期(DFS) (P=0.037)密切相關(guān)。9. PGRN通過AKT信號通路促進(jìn)CRC細(xì)胞TNFR2的表達(dá)IHC檢測發(fā)現(xiàn)TNFR2與PGRN表達(dá)呈明顯正相關(guān)(P=0.006)；上調(diào)PGRN表達(dá)后,SW480細(xì)胞、SW1116細(xì)胞中TNFR2蛋白表達(dá)明顯升高；下調(diào)PGRN表達(dá)后,SW480細(xì)胞、SW1116細(xì)胞中TNFR2蛋白表達(dá)明顯降低；PGRN重組蛋白處理后,SW480細(xì)胞、SW1116細(xì)胞中TNFR2蛋白表達(dá)明顯升高：上調(diào)PGRN表達(dá)或PGRN重組蛋白處理后,SW480細(xì)胞、SW1116細(xì)胞中p-ERK、p-AKT表達(dá)水平均明顯升高；加入AKT阻滯劑LY294002, PGRN誘導(dǎo)的TNFR2表達(dá)上調(diào)被明顯抑制。結(jié)論1. PGRN在CRC中高表達(dá),并與CRC的進(jìn)展和不良預(yù)后密切相關(guān)。2. PGRN通過TNFR2/AKT和ERK信號通路促進(jìn)了CRC的增殖和血管生成。3. PGRN通過TNFR2/AKT和ERK信號通路促進(jìn)了CRC間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化。4. TNFR2在CRC組織中高表達(dá),并與CRC的進(jìn)展和不良預(yù)后密切相關(guān)。5. PGRN可以通過AKT信號通路促進(jìn)CRC細(xì)胞TNFR2的表達(dá)
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34
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本文編號：1657976