本文選題：脫氧膽酸　切入點(diǎn)：腸道菌群　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的腸癌是全世界最常見的腫瘤之一。抑癌基因腺瘤性息肉病基因(adenomatous polyposis coli gene,Apc)突變是腸癌形成多步驟過程中的早期事件。高脂飲食在改變腸道菌群的同時(shí)增加腸腔內(nèi)脫氧膽酸(deoxycholic acid,DCA)的含量,而DCA水平持續(xù)升高與腸癌發(fā)生顯著相關(guān),然而腸道菌群與腸癌發(fā)生的因果關(guān)系尚未明確。本研究擬以腸腺瘤病小鼠模型Apc~(min/+)小鼠為研究對(duì)象,探討DCA促進(jìn)腺瘤惡變過程中腸道菌群的改變,運(yùn)用菌群移植誘導(dǎo)腸腺瘤惡變并探索其機(jī)制。方法第一部分為探討DCA促進(jìn)Apc~(min/+)小鼠腺瘤惡變過程中腸道菌群改變,我們將4周齡野生型小鼠和Apc~(min/+)小鼠分為三組:野生型組(含0.2%DCA飲用水)、Apc~(min/+)對(duì)照組(常規(guī)飲食水)和Apc~(min/+)DCA組(簡稱DCA組)。實(shí)驗(yàn)0周和12周時(shí)收集新鮮糞便以行16S r RNA菌群檢測(cè)。顯微鏡下觀察并記錄腸道腺瘤的數(shù)目、大小及分布情況。HE染色評(píng)估腸道腫瘤病理類型,免疫組化評(píng)估腫瘤細(xì)胞增殖情況,TUNEL技術(shù)評(píng)估腫瘤細(xì)胞凋亡。Realtime-PCR及免疫熒光評(píng)價(jià)腸道上皮緊密連接分子m RNA和蛋白變化。實(shí)驗(yàn)12周時(shí)予FITC-D以評(píng)價(jià)Apc~(min/+)小鼠腸上皮通透性。第二部分為探討腸道菌群與腸癌發(fā)生的因果關(guān)系,將上述對(duì)照組和DCA組在實(shí)驗(yàn)12周后停止DCA干預(yù)(經(jīng)2周DCA洗脫期),作為糞便供體。處理糞便制成糞菌液后以灌胃方式予實(shí)驗(yàn)各組小鼠(糞菌移植:FMT):FMT 1組(植入DCA組糞便的野生型小鼠)、FMT 2組(植入對(duì)照組糞便的Apc~(min/+)小鼠)、FMT3組(植入DCA組糞便的Apc~(min/+)小鼠)。各組小鼠于FMT前予鏈霉素預(yù)處理3天,8周實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)共行FMT 16次。收集實(shí)驗(yàn)8周時(shí)各組小鼠糞便檢測(cè)菌群變化。評(píng)估FMT后腸道腫瘤生長及細(xì)胞增殖情況。Realtime-PCR檢測(cè)FMT后腸粘膜炎性因子m RNA水平,同時(shí)檢測(cè)糞菌液刺激后結(jié)腸腫瘤細(xì)胞分泌的炎性因子m RNA水平;并運(yùn)用免疫熒光雙染等方法評(píng)價(jià)FMT后腸道腫瘤微環(huán)境中單核-巨噬系統(tǒng)活化情況。免疫組化和Western blot方法檢測(cè)TLR4/My D88和Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況。第三部分為進(jìn)一步明確腸道菌群在腸癌發(fā)生中的重要作用,將4周齡Apc~(min/+)小鼠隨機(jī)分為兩組:DCA組和DCA聯(lián)合抗生素組(抗生素:0.2 g/L氨芐西林、0.1 g/L萬古霉素、0.2 g/L新霉素和0.2 g/L甲硝唑)。實(shí)驗(yàn)12周時(shí)處死小鼠,于解剖顯微鏡和HE染色觀察腸道腺瘤生長及癌變情況。結(jié)果第一部分(1)實(shí)驗(yàn)12周后野生型組小鼠腸道未出現(xiàn)腫瘤,且腸道組織結(jié)構(gòu)無明顯異常。對(duì)照組全腸道散在小腺瘤,多為管狀腺瘤,偶伴低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變;DCA組腸道腺瘤總數(shù)明顯增多,以小腸中、遠(yuǎn)段及大腸腺瘤數(shù)目顯著;腸道腺瘤成簇密集出現(xiàn),部分結(jié)腸近端有巨大腺瘤生長;遠(yuǎn)段小腸及70%結(jié)腸腺瘤為粘膜內(nèi)癌,余30%結(jié)腸腺瘤為高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變。同時(shí)DCA使腸道腫瘤細(xì)胞增殖明顯增多,凋亡細(xì)胞數(shù)顯著下降。(2)DCA使腸道菌群多樣性明顯降低,并使厚壁菌門/擬桿菌門比例失衡。DCA加重腸道菌群失衡,表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)12周較實(shí)驗(yàn)0周時(shí)腸道菌群構(gòu)成中致病菌如梭菌屬、脫硫弧菌屬、埃希-志賀菌屬等比例明顯增高,而益生菌如乳酸桿菌屬、瘤胃球菌屬、毛螺旋菌等比例則降低。(3)DCA使腸組織炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)水平顯著上調(diào)。(4)DCA下調(diào)腸上皮緊密連接蛋白指標(biāo)ZO-1及Claudin3基因表達(dá)水平;FITC-D示DCA使Apc~(min/+)小鼠腸上皮通透性顯著增加。第二部分(1)FMT1組腸道無腫瘤發(fā)生。FMT3組腸道腺瘤總數(shù)明顯增多,且72.7%(8/11)近段小腸腺瘤為粘膜內(nèi)癌;腫瘤細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多。(2)PCA分析顯示FMT2組與FMT3組腸道微生物群落在PC2與PC3維度上具有差異。實(shí)驗(yàn)12周時(shí)FMT3組厚壁菌門/擬桿菌門下降,腸道菌群構(gòu)成中致病菌如埃希-志賀菌屬、副擬桿菌屬、脫硫弧菌屬、加式螺桿菌等明顯增多,而益生菌如乳酸桿菌屬、羅氏菌屬、瘤胃球菌屬、毛螺旋菌、柔嫩梭菌則明顯降低。(3)DCA組糞菌液刺激IMCE和HT-29細(xì)胞系后,炎性細(xì)胞因子基因水平明顯上調(diào)。FMT 3組腸組織炎性細(xì)胞因子、MCP-1及巨噬細(xì)胞F4/80顯著增多;且腫瘤間質(zhì)中M2型巨噬細(xì)胞表面分子比例增多,而M1型巨噬細(xì)胞表面分子比例減少。(4)FMT3組腸道TLR4及My D88表達(dá)明顯上調(diào)、cadherin-E表達(dá)顯著減弱,β-catenin出現(xiàn)核異位表達(dá),cyclin D1表達(dá)增多。第三部分從整體水平上調(diào)控腸道菌群可削弱DCA誘導(dǎo)的Apc~(min/+)小鼠腸道腫瘤進(jìn)展,表現(xiàn)為腫瘤數(shù)目減少、直徑更小、癌變率降低。結(jié)論DCA介導(dǎo)的腸道微生態(tài)失衡可破壞腸粘膜屏障,誘導(dǎo)腸道低度炎癥發(fā)生,通過激活單核-巨噬系統(tǒng),使巨噬細(xì)胞發(fā)生M1至M2型極化,進(jìn)而激活腫瘤相關(guān)信號(hào)通路促使腸腺瘤惡變。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.3

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