本文選題：乳腺癌　切入點(diǎn)：上皮細(xì)胞粘附分子　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：乳腺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。乳腺癌占全身各種惡性腫瘤的7%-8%,國(guó)內(nèi)發(fā)病率高于世界平均水平1%-2%,目前乳腺癌多采用手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療等,手段單一,難以達(dá)到滿意的效果。因此尋找有效治療乳腺癌的方法具有一定的臨床意義。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)指腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí),伴隨著細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,即上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變,侵入到基底膜下面,進(jìn)入到血管中散播至第二個(gè)地方。在此過(guò)程中,腫瘤細(xì)胞從原發(fā)位置脫落,然后侵入到周圍的組織中,獲得了浸潤(rùn)性和游走的遷移能力,突破細(xì)胞之間的接觸,形成細(xì)胞-基質(zhì)的粘附位點(diǎn),通過(guò)基質(zhì)中的蛋白酶來(lái)完成趨化過(guò)程。一些研究表明,EMT與上皮細(xì)胞腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程具有密切的聯(lián)系。目前已發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移可以改變粘附分子(Cell Adhesion Molecules,CAMs)的表達(dá)。腫瘤細(xì)胞表面CAMs表達(dá)異常,可能會(huì)造成腫瘤細(xì)胞粘附性降低而脫落到細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix,ECM)中,促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移過(guò)程。上皮細(xì)胞粘附分子(Epithelial Cell Adhesion Molecule,EpCAM)是由314個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的分子量為40 k Da的跨膜糖蛋白,包含N-端的胞外區(qū),跨膜區(qū)和C-端的胞內(nèi)區(qū)。EpCAM是不同于CAMs經(jīng)典家族成員,具有潛在的致癌性。在正常條件下,除鱗狀上皮細(xì)胞,EpCAM在正常上皮細(xì)胞中都有不同程度地表達(dá)。在病理情況下,EpCAM在腺癌中高表達(dá),包括乳腺癌、肺腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。EpCAM一級(jí)結(jié)構(gòu)顯示,EpCAM N-端細(xì)胞外域包含三個(gè)N-糖基化位點(diǎn),分別是Asn74、Asn111、Asn198。文獻(xiàn)已報(bào)道,將此三個(gè)糖基化位點(diǎn)去除可使EpCAM的半衰期由21小時(shí)縮短至7小時(shí),表明N-糖基化位點(diǎn)對(duì)于維持EpCAM的功能是必不可少的。另外,與正常組織相比,EpCAM糖基化的差異是引起腫瘤功能差異的重要因素。因此,推測(cè)在乳腺癌細(xì)胞中EpCAM的N-糖基化修飾可能是激活和調(diào)節(jié)EMT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵。本課題前期工作致力于EpCAM對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT的調(diào)節(jié)作用和機(jī)制研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí):在TGF-β1誘導(dǎo)下通過(guò)JNK通路,轉(zhuǎn)錄因子AP-1調(diào)控EpCAM的表達(dá)從而影響乳腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)深入探究EpCAM N-糖基化修飾對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT的調(diào)控機(jī)制,為乳腺癌的治療方法提供一定的理論基礎(chǔ)。首先,將EpCAM N-糖基化突變質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到乳腺癌細(xì)胞(MCF-7、MDA-MB-231),結(jié)果表明EpCAM在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)糖基化和非糖基化蛋白兩種形式。通過(guò)細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè),結(jié)果提示EpCAM N-糖基化突變沒(méi)有改變EpCAM的表達(dá)定位。將EpCAM N-糖基化突變質(zhì)粒聯(lián)合TGF-β1作用于乳腺癌細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)EMT分子標(biāo)記物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)表達(dá)量上升,N-鈣粘蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimention)表達(dá)量下降。結(jié)果提示,EpCAM N-糖基化修飾調(diào)控乳腺癌細(xì)胞EMT發(fā)生。將EpCAM N-糖基化突變質(zhì)粒聯(lián)合TGF-β1和ERK1/2和PI3K/Akt的抑制劑作用于兩種乳腺癌細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EMT分子標(biāo)記物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)表達(dá)量上升,N-鈣粘蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimention)表達(dá)量下降,ERK1/2和PI3K/Akt信號(hào)通路中p Raf-1、p ERK、p Akt表達(dá)量下降。結(jié)果表明,TGF-β1誘導(dǎo)下,EpCAM N-糖基化修飾經(jīng)由MAPK/PI3K/Akt通路對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT存在抑制作用。綜上所述,TGF-β1誘導(dǎo)下,EpCAM N-糖基化修飾通過(guò)MAPK和PI3K/Akt通路來(lái)調(diào)控乳腺癌細(xì)胞EMT。整合素作為細(xì)胞表面重要的粘附分子,參與細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附過(guò)程,參與細(xì)胞內(nèi)外的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)。從而參與細(xì)胞分裂、粘附、凋亡等生物特定行為的調(diào)控。細(xì)胞也可根據(jù)自身狀態(tài)及需要調(diào)節(jié)整合素與配體的親和力,影響細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附及遷移。在乳腺癌細(xì)胞(MCF-7、MDA-MB-231)中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染EpCAM N-糖基化突變質(zhì)粒處理48小時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,降低纖維連接蛋白(Fibronectin,FN)和integrinβ1蛋白表達(dá),從而進(jìn)一步激活由integrinβ1調(diào)節(jié)下游關(guān)鍵性的粘著斑激酶(Focal Adhension Kinase,FAK)同時(shí),降低了p FAK、p Scr的蛋白表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),FAK可以誘導(dǎo)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活,采用FAK特異性抑制劑PF-573228聯(lián)合EpCAM N-糖基化突變質(zhì)粒作用于兩種乳腺癌細(xì)胞中處理48小時(shí),結(jié)果提示,PI3K/Akt信號(hào)通路中p Akt、p GSK3β、β-catenin和MMP-2/MMP-9蛋白表達(dá)量下降。因此,乳腺癌細(xì)胞中EpCAM N-糖基化修飾通過(guò)抑制integrinβ1和FN表達(dá),通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路,轉(zhuǎn)錄因子β-catenin調(diào)節(jié)MMP-2/MMP-9表達(dá)降低乳腺癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)分子的粘附。綜上所述,EpCAM N-糖基化修飾可以調(diào)控乳腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生和乳腺癌細(xì)胞與胞外基質(zhì)分子的粘附。本實(shí)驗(yàn)闡明了乳腺癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中EpCAM N-糖基化修飾調(diào)控EMT的分子機(jī)制,并且為臨床上乳腺癌的基因治療方案的選擇、基因治療藥物的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。EpCAM作為靶點(diǎn)對(duì)乳腺癌的治療,提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.9

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