本文選題：香煙煙霧　切入點：氣道上皮細(xì)胞　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率居各類腫瘤之首,是嚴(yán)重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤。我國是煙草消費大國,特別是近年來,隨著我國工業(yè)化進程的加速,空氣污染日趨嚴(yán)重,肺癌發(fā)病不容樂觀。據(jù)我國近期公布的中國腫瘤發(fā)病率和死亡率統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,肺癌是我國發(fā)病率最高的癌癥,并呈現(xiàn)較快的增長趨勢,是嚴(yán)重危害我國城鄉(xiāng)人口健康的重大疾病。吸煙被認(rèn)為是引起肺癌最重要的環(huán)境因素,據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)報道,吸煙者肺癌的發(fā)生風(fēng)險較非吸煙者高近10倍,而及時戒煙可降低肺癌發(fā)生率。香煙煙霧中含有數(shù)千種化學(xué)物質(zhì),其中包含多種致癌物質(zhì),如芳香烴類、N-亞硝胺類、雜環(huán)胺、甲醛等,同時還包含一氧化氮、一氧化碳、硫化氫等在內(nèi)的多種有害氣體及重金屬和放射性物質(zhì)。此外,二手煙暴露亦被認(rèn)為是肺癌發(fā)生的重要環(huán)境因素,二手煙中含有苯并芘、N-亞硝胺等在內(nèi)的250余種有毒有害物質(zhì)。吸煙被認(rèn)為具有誘導(dǎo)生命體抗氧化能力下降和干擾DNA損傷修復(fù)能力,最終導(dǎo)致腫瘤、心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)退行性病變等多種疾病的發(fā)生。DNA是染色體主要組成成分,是生命體主要遺傳物質(zhì),其分子結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定性是維持細(xì)胞正常生理功能的基礎(chǔ)。各種內(nèi)源性和外源性因素均可引起DNA損傷,DNA損傷后細(xì)胞啟動修復(fù)或誘導(dǎo)凋亡。然而,當(dāng)細(xì)胞對DNA損傷修復(fù)的異常反應(yīng)可導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定,最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。吸煙是肺癌最重要的危險因素,然而吸煙引起肺癌的機制仍不清楚。本研究擬探討香煙煙霧暴露與氣道上皮細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的潛在聯(lián)系,從而為肺癌的防治提供實驗數(shù)據(jù)。第一部分香煙煙霧暴露誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)目的：探討香煙煙霧暴露是否可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)(DDR),并進一步探討氣道上皮細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)機制。方法：香煙煙霧提取物(CSE)干預(yù)人體正常氣道上皮細(xì)胞HBE,利用流式細(xì)胞技術(shù)、克隆形成實驗和CCK8法檢測CSE對HBE細(xì)胞增殖和凋亡的影響。分別利用β-半乳糖苷酶染色、免疫熒光染色法和吉姆薩染色法,觀察CSE干預(yù)HBE后細(xì)胞的衰老反應(yīng)、DDR和染色體結(jié)構(gòu)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測CSE干預(yù)對HBE的細(xì)胞周期影響。DNA纖維形成實驗探討香煙煙霧暴露后氣道上皮細(xì)胞DNA復(fù)制速度變化。Western Blot分析CSE干預(yù)后,DNA損傷修復(fù)蛋白XRCC1、RPA、USP1及范可尼家族蛋白的表達水平,Q-PCR方法觀察HBE細(xì)胞經(jīng)香煙煙霧暴露后FANCD2、FANCI的nRNA表達。結(jié)果：CSE可抑制HBE細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)HBE細(xì)胞凋亡,并呈現(xiàn)濃度和劑量依賴效應(yīng)。HBE細(xì)胞經(jīng)CSE干預(yù)后染色體斷裂增加,細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的DDR。但本實驗條件下,未觀察到CSE誘導(dǎo)的HBE細(xì)胞衰老反應(yīng)。CSE作用HBE細(xì)胞后,G1期細(xì)胞數(shù)量增加,且DDR多發(fā)生于Cyclin A陽性細(xì)胞,提示DDR發(fā)生可能與DNA復(fù)制相關(guān)。DNA纖維形成實驗表明,CSE干預(yù)后HBE細(xì)胞DNA復(fù)制速度下降,多集中在0.2kb/min-0.8kb/min,而對照組DNA復(fù)制速度主要分布于0.6kb/min-1.2kb/min。此外,CSE可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞中范可尼家族蛋白FANCD2和FANCI的表達下調(diào)。結(jié)論：香煙煙霧暴露可降解FANCD2、FANCI蛋白,誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞DDR。第二部分IL-17促進香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的基因組不穩(wěn)定和DNA損傷反應(yīng)目的：探討IL-17是否參與了香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的基因組不穩(wěn)定和DNA損傷反應(yīng)(DDR)。方法：C57BL/6小鼠與IL-17-/-小鼠分別隨機分成香煙煙霧暴露組與對照組,每組數(shù)量在10只以上,實驗組小鼠置于香煙煙霧暴露裝置中(Teague Enterprises)。每日香煙煙霧暴露總量為100支,每周暴露5天。暴露12周后,收集小鼠肺泡灌洗液(BALF)和肺、腦、食管、心臟、肝臟、脾、腎、胃、腸、膀胱組織。流式細(xì)胞技術(shù)檢測小鼠BALF中細(xì)胞DDR, HE染色觀察小鼠各臟器病理形態(tài)學(xué)變化,免疫組織化學(xué)染色法(IHC)觀察各臟器的DDR,并檢測IL-17的表達及其與DDR的相關(guān)性。免疫熒光染色分析IL-17干預(yù)后HBE細(xì)胞的DDR,并探討ATM與ATR是否參與了IL-17誘導(dǎo)的DDR。IHC觀察吸煙與不吸煙者肺組織和膀胱組織DDR與IL-17表達,并分析二者的相關(guān)性。結(jié)果：香煙煙霧暴露12周后,C57BL/6小鼠肺和膀胱組織出現(xiàn)DDR,而腦、食管、心臟、肝臟、脾、腎、胃、腸組織均未發(fā)生明顯的DDR, HE染色提示香煙煙霧暴露引起肺組織炎癥細(xì)胞浸潤,肺組織DDR與炎癥評分有潛在聯(lián)系。香煙煙霧暴露C57BL/6小鼠后,肺組織和膀胱組織IL-17表達上調(diào),且與DDR呈正相關(guān)。香煙煙霧暴露IL-17-/-小鼠12周后,其肺組織DDR較香煙煙霧暴露的野生型小鼠明顯下降。IL-17可體外誘導(dǎo)HBE細(xì)胞DDR, ATM與ATR抑制劑可有效阻斷IL-17誘導(dǎo)的HBE細(xì)胞H2AX磷酸化。與不吸煙者相比,吸煙者肺組織和膀胱組織DDR與IL-17表達增高,且二者之間存在顯著的相關(guān)性。結(jié)論：IL-17促進了香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的多臟器基因組不穩(wěn)定與DDR。第三部分吸煙誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激DNA損傷反應(yīng)與肺癌高度相關(guān)目的：探討吸煙與不吸煙肺癌和非癌對照患者肺組織氧化應(yīng)激DNA損傷反應(yīng)水平。方法：免疫熒光染色觀察CSE干預(yù)氣道上皮細(xì)胞后8-OHdG的表達水平變化。C57BL/6小鼠隨機分組,實驗組小鼠置于香煙煙霧暴露裝置中。香煙煙霧分別暴露12周與24周后,收集肺組織標(biāo)本。同時,收集88例因肺部疾病行氣管鏡檢查的患者肺泡灌洗液(BALF),并收集病人一般資料。所有納入研究者均獲得病理學(xué)診斷,其中有50例肺癌患者和38例良性對照,兩組之間在性別、年齡、吸煙史上無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。ELISA法檢測BALF中8-OHdG表達水平,免疫組織化學(xué)染色(IHC)法評價肺組織8-OHdG表達水平,分別比較吸煙與不吸煙的肺癌及非癌對照患者肺組織的氧化應(yīng)激DNA損傷反應(yīng)。結(jié)果：體內(nèi)外實驗表明,香煙煙霧暴露誘導(dǎo)HBE細(xì)胞和小鼠肺組織8-OHdG表達增加,暴露24周小鼠比12周小鼠的肺組織存在更高的氧化應(yīng)激DNA損傷反應(yīng)。肺癌患者BALF中8-OHdG濃度為5.4±0.6ng/ml,非癌對照組為2.3±0.4ng/ml,兩組之間具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.0002)。根據(jù)病理分型,磷癌、腺癌、小細(xì)胞肺癌BALF中8-OHdG表達水平均較非癌對照組高,且BALF中8-OHdG表達水平與TNM分期密切相關(guān)。此外,肺癌和非癌對照組BALF中8-OHdG濃度在吸煙者中分別較不吸煙者增高,并與吸煙指數(shù)呈正相關(guān)。IHC結(jié)果進一步驗證了BALF中的研究發(fā)現(xiàn)。當(dāng)BALF中8-OHdG表達水平為2.86ng/ml時,對肺癌診斷的敏感性和特異性分別為70.0%和73.7%。結(jié)論：吸煙與肺組織的氧化應(yīng)激DNA損傷反應(yīng)密切相關(guān),8-OHdG可能是肺癌潛在的生物標(biāo)志物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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