本文選題：鹽霉素　切入點(diǎn)：膠質(zhì)瘤　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：膠質(zhì)瘤指源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的腦部腫瘤。流行病學(xué)資料顯示膠質(zhì)瘤在全部中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤類(lèi)型所占比例為27%,在惡性腫瘤類(lèi)型所占比例為80%,是最常見(jiàn)原發(fā)性腫瘤類(lèi)型。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)將膠質(zhì)瘤分級(jí)WHO Ⅰ～Ⅳ級(jí),以判斷腫瘤惡性程度。高級(jí)別膠質(zhì)瘤具有較強(qiáng)的侵襲性,臨床治療效果差,患者預(yù)后不佳,平均生存率只有12-15個(gè)月。盡管采取目前的方法來(lái)治療膠質(zhì)瘤其療效不能讓人滿(mǎn)意,但是手術(shù)切除后和放療后采取合適的化療藥物進(jìn)行化療仍然是不可替代的方案。鹽霉素(salinomycin,SAL)為一種一元羧酸聚醚類(lèi)動(dòng)物專(zhuān)用抗生素。2009年,美國(guó)人率先證實(shí)SAL能夠有效地殺死乳腺癌腫瘤干細(xì)胞。之后SAL在各類(lèi)腫瘤實(shí)驗(yàn)性研究被證實(shí)對(duì)多種類(lèi)型腫瘤細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞具有抑制與殺傷,如鼻咽癌,骨肉瘤,肝細(xì)胞癌,膽管癌,胃癌以及膠質(zhì)瘤等。鹽霉素抗腫瘤的機(jī)制研究表明其具有廣譜的抗癌活性,它可能通過(guò)激活非傳統(tǒng)的細(xì)胞死亡途徑,誘導(dǎo)脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)損傷,抑制Wnt信號(hào)通路,凋亡和/或自噬,抗血管新生等機(jī)制發(fā)揮作用。報(bào)道據(jù)鹽霉素能夠提高細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)含量,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死,DNA損傷以及抑癌基因p53活化抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增生。而且大量證據(jù)提示,ROS在SAL抗癌作用機(jī)理中起到主要作用。然而鹽霉素利用氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此在本研究中,將評(píng)價(jià)在鹽霉素引起U87人膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期阻滯的過(guò)程中,ROS、DNA損傷以及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/theronine protein kinase,AKT)失活所起到的作用。血管生成機(jī)制為腫瘤向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與生長(zhǎng)機(jī)制當(dāng)中主要組成部分。腫瘤只有在豐富的血管床支持下,在得到足夠的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上才可能生長(zhǎng)與延伸,因此血管發(fā)生與腫瘤生長(zhǎng)是平行的。腫瘤組織內(nèi)新血管生成為多重機(jī)制參與,多個(gè)成分參加的復(fù)雜過(guò)程,并且受到由腫瘤細(xì)胞等分泌的促血管生成與抗血管生成因子調(diào)節(jié)。兩種因子生成達(dá)到平衡時(shí),血管新生處于相對(duì)靜止,而平衡破壞時(shí)即觸發(fā)血管新生。腫瘤血管生成有2種基本形式,出芽與套疊式血管生成。腫瘤血管生成特點(diǎn)比較突出,如高度增殖的內(nèi)皮細(xì)胞,血管通透性比較高以及促血管生長(zhǎng)因子分泌旺盛,因此可以將血管生成作為治療新靶點(diǎn)。當(dāng)血管生成啟動(dòng)后,腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌出促血管形成因子誘導(dǎo)內(nèi)皮增殖。由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的具有促血管生成效應(yīng)的分子逐漸被人們所認(rèn)識(shí),也鑒定出多種類(lèi)似于內(nèi)皮細(xì)胞分泌的促血管生成分子。最近許多文獻(xiàn)報(bào)道,以血管生成的調(diào)節(jié)因子為治療靶點(diǎn),通過(guò)小分子受體阻滯抑制劑、特異性抗體或內(nèi)源性抑制劑來(lái)抑制內(nèi)皮細(xì)胞聚積。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)以血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作為治療靶點(diǎn)可以有效阻滯血管發(fā)生。VEGF是組織結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)的細(xì)胞因子家族當(dāng)中非常重要的一員,在血管發(fā)生、促進(jìn)細(xì)胞生存、生長(zhǎng)方面起到重要作用,并和VEGF受體結(jié)合調(diào)節(jié)動(dòng)脈、靜脈中內(nèi)皮增殖。目前已經(jīng)鑒定出三種不同血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factorreceptor,VEGFR),VEGFR-1(Flt-1),VEGFR-2(Flk-1)和 VEGFR-3。局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)為一種胞漿蛋白質(zhì)絡(luò)氨酸激酶,與整合蛋白介導(dǎo)的通路密切相關(guān),在細(xì)胞增生,存活與遷移活動(dòng)內(nèi)起到關(guān)鍵作用。整合蛋白聚類(lèi)激活FAK,后者又引起PI3K結(jié)合位點(diǎn)Tyr397磷酸化。已有文獻(xiàn)證實(shí)不論是整合蛋白介導(dǎo)FAK活化,或是生長(zhǎng)因子刺激促進(jìn)了 PI3K/Akt下游途徑活化,均會(huì)引起癌性轉(zhuǎn)移前蛋白過(guò)度表達(dá),例如基質(zhì)金屬蛋白酶與VEGF。鹽霉素抗腫瘤機(jī)制研究中有證據(jù)顯示,其通過(guò)引起DNA損傷與線(xiàn)粒體功能障礙,以及 FOX03a,Wnt/β-catenin,STAT3/Skp2 和 Akt/NF-κB/mTOR 信號(hào)通路參與的ROS聚集這些機(jī)制來(lái)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。但是少有文獻(xiàn)報(bào)道SAL對(duì)腫瘤血管發(fā)生影響。因此本研究將鹽霉素作為血管生成抑制劑評(píng)價(jià)其在離體和在體情況下的抗癌作用。并探究其抑制血管生成和引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡的潛在機(jī)制。目的1.探討SAL在離體情況下對(duì)U87與U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和在體情況下對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)的抑制,圍繞細(xì)胞周期阻滯探討潛在機(jī)制。2.探討SAL在離體情況下對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖、遷移、侵襲和血管形成能力的影響,在體情況下對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用,圍繞血管生成探討其潛在機(jī)制。方法1.體外培養(yǎng)U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞并擴(kuò)增,設(shè)正常對(duì)照組和SAL治療組。以不同濃度SAL(0,1,2,4,8μM)治療48h,倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)法檢測(cè)細(xì)胞活力。應(yīng)用細(xì)胞流式技術(shù)分析細(xì)胞周期分布。DCFH-DA探針測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平,超氧陰離子試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子含量。蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定 SAL 對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子 CyclinA、CDK-2、CyclinB1 和 CyclinD1,DNA損傷標(biāo)記蛋白H2A和p53,和其他信號(hào)途徑蛋白(AKT)表達(dá)影響。應(yīng)用各種蛋白抑制劑與ROS清除劑谷胱甘肽探討SAL對(duì)細(xì)胞周期影響。構(gòu)建U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植瘤模型,分組設(shè)對(duì)照,對(duì)比移植瘤大體形態(tài)參數(shù)與模型體重。對(duì)腫瘤標(biāo)本進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法與免疫組織化學(xué)分析。2.體外培養(yǎng) HUVECs 并擴(kuò)增。不同濃度(0 uM,0.1 uM,0.5 uM,1 uM,2 uM,4 uM,8 uM)的SAL作用HUVECs 48 h。倒置相差顯微鏡記錄細(xì)胞形態(tài),MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。劃痕試驗(yàn)、體外侵襲實(shí)驗(yàn)和促血管形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)SAL作用后HUVECs的遷移能力、侵襲能力和血管形成能力,并設(shè)立陽(yáng)性(VEGF)和陰性(順鉑)對(duì)照。蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定SAL對(duì)血管生成調(diào)節(jié)因子VEGF,VEGF受體,以及其他信號(hào)途徑蛋白(p-FAK、FAK、AKT、p-AKT)表達(dá)的影響。增加使用各種蛋白抑制劑探究SAL對(duì)血管發(fā)生影響。構(gòu)建U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植瘤模型,分組設(shè)對(duì)照,對(duì)比移植瘤大體形態(tài)參數(shù)與模型體重。對(duì)腫瘤標(biāo)本進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法與免疫組化分析。結(jié)果1.在SAL作用下,由MTT分析得到的U87和U251細(xì)胞活力受到明顯抑制,呈劑量依賴(lài)性;鏡下顯示細(xì)胞萎縮,突觸縮減,數(shù)量變小。流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果表明SAL主要誘導(dǎo)U87細(xì)胞S期和U251細(xì)胞G1期細(xì)胞周期抑制,蛋白質(zhì)印跡法顯示Cyclin A、CDK-2、Cyclin B1和Cyclin D1表達(dá)下調(diào),結(jié)果保持一致。SAL作用下細(xì)胞內(nèi)ROS和超氧陰離子水平增高,H2A和p53表達(dá)增強(qiáng),而增加谷胱甘肽后H2A和p53表達(dá)下降,提示ROS引起DNA損傷。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示SAL作用下p-AKT表達(dá)下調(diào),增加LY294002(AKT抑制劑)后表現(xiàn)出兩者的協(xié)同作用,增加谷胱甘肽后兩者表現(xiàn)出對(duì)p-AKT表達(dá)的拮抗作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示腫瘤標(biāo)本體積和重量受到SAL抑制。免疫組化結(jié)果顯示腫瘤組織內(nèi)的細(xì)胞增生(Ki-67染色)和血管發(fā)生(CD-31染色)同樣受到抑制。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果鹽霉素激活了 Ser15-p53和Ser139-H2A,抑制了 AKT和cyclinA表達(dá)。綜合以上結(jié)果表明,鹽霉素在體內(nèi)可以抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)。2.MTT分析提示SAL對(duì)HUVECs生長(zhǎng)具有劑量依賴(lài)性抑制作用,鏡下顯示細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞形態(tài)萎縮和變圓。劃痕試驗(yàn)、體外侵襲實(shí)驗(yàn)和促血管形成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示鹽霉素能夠阻止HUVECs遷移,侵襲和形成類(lèi)毛細(xì)血管形成。蛋白質(zhì)印跡法提示SAL作用下p-FAK表達(dá)下調(diào),聯(lián)合使用PF562271能增強(qiáng)這種作用,提示SAL抑制HUVECs中FAK的磷酸化。蛋白質(zhì)印跡法還表明,SAL作用下VEGF、p-VEGFR2與p-AKT表達(dá)下降,提示SAL干擾了VEGF-VEGFR2-AKT信號(hào)途徑。SAL作用下在體腫瘤體積和重量下降,免疫熒光染色顯示細(xì)胞增生的標(biāo)記物Ki-67和造血祖細(xì)胞標(biāo)記物CD34表達(dá),同時(shí)蛋白質(zhì)印跡法顯示治療組織內(nèi)p-FAK和p-AKT表達(dá)減少,以上結(jié)果提示鹽霉素通過(guò)阻礙血管新生抑制體內(nèi)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)。結(jié)論1.鹽霉素通過(guò)ROS介導(dǎo)的DNA損傷和AKT失活引起細(xì)胞周期阻滯,從而抑制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)。2.鹽霉素通過(guò)干擾VEGF-VEGFR2-AKT/FAK信號(hào)軸能夠阻止血管生成和抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R739.41

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本文編號(hào)：1637649