本文選題：micro　切入點：RNA-302c-3p　出處：《山西醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：人腦膠質(zhì)瘤,起源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)細胞或其前體,是成人原發(fā)性腦腫瘤最常見的形式,約占整個顱內(nèi)腫瘤的30%,高度惡性腦膠質(zhì)瘤(WHOⅢ、Ⅳ級)沒有成功的治療方法,確診后病人的平均生存時間約為12-15個月.由于膠質(zhì)瘤具有高度侵襲性和浸潤正常腦組織,因此手術(shù)難以全切,預(yù)后不佳,且術(shù)后復(fù)發(fā)率高,易發(fā)生顱內(nèi)或脊髓及其他部位轉(zhuǎn)移,病程進展快,一年生存率不足50%。腦膠質(zhì)瘤的治療包括手術(shù)切除聯(lián)合放療加化療或靶向治療,這樣能顯著增加生存率,然而高級別膠質(zhì)瘤和預(yù)后差之間的相關(guān)性的機制仍然未知,因而,有關(guān)顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的發(fā)病機理以及治療方法研究一直以來都是神經(jīng)科學領(lǐng)域研究的熱點。所有級別的神經(jīng)膠質(zhì)瘤是以不適當?shù)脑鲋?浸潤正常的腦組織為特征的,從而破壞正常的腦功能。所以只有明確膠質(zhì)瘤致病分子機制,我們才可以找到新的治療方法。Micro RNA(mi RNA)是21到23個核苷酸的內(nèi)源性非編碼的小的核糖核酸序列,在翻譯后水平通過結(jié)合目標信使RNAs的3′UTR區(qū)域的互補序列,來負調(diào)控基因表達,在轉(zhuǎn)錄后水平誘導信使RNA降解或翻譯抑制的表達。許多mi RNAs被證明是原癌基因或在多種人類腫瘤中腫瘤抑制基因,包括膠質(zhì)瘤.近年來的研究表明,mi RNAs,如mi R-7,mir-124,mir-128,mi R-107,和mi R-181b,在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中都是異常調(diào)節(jié)。然而,通過其中哪一種mi RNA介導膠質(zhì)瘤腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移特定的分子機制仍在很大程度上是未知的。因此,確認并鑒定新的mi RNA在膠質(zhì)瘤中的作用,可提供新的視點來理解腦膠質(zhì)瘤發(fā)展的分子機制。Micro RNA-302c-3p(mi R-302c-3p)是mi R-302/367家族家族中的重要一員,人源mi R-302/367家族基因定位于4號染色體q25區(qū),包括mi R-302a/b/c/d和mi R-367等成員。早期的研究主要集中于mi R-302/367可以作為重要的調(diào)節(jié)因子在胚胎干細胞作用,包括干細胞更新和多能性的維持等功能。近年來的研究表明,mi R-302/367在腫瘤、免疫性疾病和心血管等疾病中也具有重要的調(diào)節(jié)功能,通過靶向調(diào)節(jié)不同靶基因在不同的疾病中發(fā)揮著不同的生物學作用。腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個多階段、多因素參與的復(fù)雜的生物學過程。已有研究結(jié)果表明,mi RNAs幾乎參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的整個過程,其中mi R-302/367在多種腫瘤中扮演著重要的角色�；贚eivonen?s的研究,mir-302c在實驗?zāi)Ｐ椭械谋磉_是降低的,其他人發(fā)現(xiàn)它可能參與了肝癌轉(zhuǎn)移,并建議mir-302c可能在膠質(zhì)瘤演進中發(fā)揮重要作用。在本項研究中,我們首先檢測mi R-302c-3p在腦膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織中表達,以及通過一系列的體外和體內(nèi)實驗研究,然后進行調(diào)查探索影響mir-302c-3p在膠質(zhì)瘤中表達的機制。通過生物信息學分析軟件(RNA22)和實驗驗證,我們發(fā)現(xiàn)異粘蛋白(MTDH)是mi R-302c-3p上調(diào)的直接的靶目標。與正常腦組織相比,膠質(zhì)瘤組織中MTDH表達上調(diào),與mi R-302c-3p表達呈負相關(guān)。最后,在體內(nèi)和體外的實驗中發(fā)現(xiàn)mi R-302c-3p的過度表達可以強烈的抑制膠質(zhì)瘤細胞的侵襲與增殖。本課題從分子水平研究mi R-302c-3p影響膠質(zhì)瘤細胞惡性生物學行為的機制,對于深入理解mi R-302c-3p的生物學功能和膠質(zhì)瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移特定的分子機制有重要意義,是膠質(zhì)瘤治療的一個潛在抑制劑,具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。本課題將從三個方面進行研究:1.mi R-302c-3p在正常人腦組織與膠質(zhì)瘤組織中的表達及意義目的:比較研究膠質(zhì)瘤與正常腦組織之間以及不同等級膠質(zhì)瘤之間mi R-302c-3p以及MTDH m RNA表達差異性。分析mi R-302c-3p的表達與膠質(zhì)瘤臨床病理分級之間的關(guān)系,在此基礎(chǔ)上,進一步通過雙熒光素酶報告基因檢測技術(shù)驗證MTDH是否為mi R-302c-3p作用的靶標蛋白。為進一步探索mi RNA-302c-3p在膠質(zhì)瘤體內(nèi)外的生物學作用奠定基礎(chǔ)。方法:利用q RT-PCR技術(shù)比較6例正常腦組織以及27例不同等級膠質(zhì)瘤之間mi R-302c-3p以及MTDH m RNA表達情況,通過雙熒光素酶報告基因檢測技術(shù)驗證MTDH與mi R-302c-3p的相關(guān)性。結(jié)果:(1)q RT-PCR法檢測結(jié)果顯示,在膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織相比,mi R-302c-3p表達水平顯著減少(0.39±0.04 vs.1.06±0.03,P0.001)。此外,mi R-302c-3p的表達水平在膠質(zhì)瘤高級別(WHOⅢ和WHOⅣ)中明顯低于那些低級別的(WHOⅠ和WHOII)(0.27±0.03 vs.0.66±0.05,P0.001);(2)MTDH與mi R-302c-3p相關(guān)性分析:我們比較了在27例人腦腫瘤與6例正常腦組織中的MTDH基因的表達水平。MTDH的表達通過實時定量PCR(q RT-PCR)分析發(fā)現(xiàn),與正常腦組織相比較,膠質(zhì)瘤組織中MTDH表達顯著增加,(p=0.0027)。與正常組織相比,MTDH基因在膠質(zhì)瘤組織中的過度表達在85.2%(23/27)。為了進一步評估在膠質(zhì)瘤中mi R-302c-3p和MTDH表達相關(guān)性,我們比較27個人腦膠質(zhì)瘤標本mi R-302c-3p和MTDH的表達。結(jié)果顯示:MTDH和mi R-302c-3p表達呈顯著負相關(guān)(P=0.003,R2=0.4065)。1.mi R-302c-3p對膠質(zhì)瘤細胞生物特性的體外研究目的:驗證mi R-302c-3p的靶目標是MTDH及與其基因表達的關(guān)系。觀察體外mi R-302c-3p的過度表達對U87MG的增殖和侵襲能力能力的影響。方法:(1)利用micro RNA生物學信息軟件RNA22發(fā)現(xiàn),發(fā)現(xiàn)mi R-302c-3p靶目標是MTDH。基于預(yù)測軟件的基礎(chǔ),RNA22(https://cm.jefferson.edu/rna22v1.0-homo_sapiens/Get Inputs.jsp),我們發(fā)現(xiàn)MTDH的3?UTR包含mi R-302c-3p種子區(qū)域互補的位點(位置2271~2293),可能是mi R-302c-3p個潛在的靶目標。為了驗證mi RNA與靶目標的相互作用并決定是否mi R-302c-3p抑制MTDH基因的表達,通過在膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)環(huán)境MTDH信使RNA的3?UTR直接相互作用,用熒光素酶檢測。為了分析評估轉(zhuǎn)染了LV-302c-3p或LV-NC的U87MG的增殖能力,實驗分為陰性對照組(LV-NC)組,轉(zhuǎn)染組(LV-302c-3p組);我們采用CCK-8細胞測定檢測細胞增殖能力。對于細胞侵襲實驗,使用一個具有BD Bio Coat Matrigel專門的小室。簡而言之,細胞(5×104細胞/毫升)裝入一個包含8毫米孔徑薄層的基質(zhì)膜小室。在24或48小時內(nèi)遷移到膜的下表面細胞的用100%甲醇固定,在膜的上表面的非侵襲細胞去除。具有侵襲細胞的膜用DAPI(D9564,Sigma)染色,掃描,用顯微鏡取得數(shù)字圖像。顯微鏡下侵襲細胞計數(shù),至少5個視野。每個實驗數(shù)據(jù)3次測量取均數(shù)用來分析。將包含靶點的序列連接進p MIR-Report vector的luciferase報告質(zhì)粒中。U87MG轉(zhuǎn)染mi RNA-302c-3p mimics(40 nmol)24小時后,再用Lipofectamine2000二次轉(zhuǎn)染攜帶野生和突變型MTDH 3’UTR。48小時后,與dual-luciferase reagents(E1483,Promega)孵育,最后用dual-luciferase reagents(E1483,Promega)檢測熒光素酶活性。CCK-8試劑盒測定轉(zhuǎn)染了LV-302c-3p或LV-NC的U87MG細胞的增殖情況,用Transwell試驗檢測mi R-302c-3p過表達對膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力的影響。結(jié)果:(1)結(jié)果表明在野生型組,mi R-302c-3p模擬抑制熒光素酶的活性大約69.6%(P=0.005),而在變異組或陰性對照組沒有明顯的變化,這表明mi R-302c-3p可以與MTDH的3?UTR的種子序列直接結(jié)合,并抑制其表達。(2)與陰性對照相比,轉(zhuǎn)染了LV-302c-3p的U87MG細胞增殖率減明顯減少(3)轉(zhuǎn)染了LV-302c-3p或LV-NC的U87MG細胞接種于基質(zhì)膠小室,經(jīng)過24小時的培養(yǎng)后具備了其侵襲能力。結(jié)果表明,與對照組相比,侵襲性U87MG細胞過量表達mi R-302c-3p的能力降低了82.4%2.mi R-302c-3p對膠質(zhì)瘤細胞生物特性的體內(nèi)研究目的:為了進一步探討mi R-302c-3p抑制在體內(nèi)的成瘤,我們把u87mg-302c-3p和u87mg-nc細胞植入裸鼠,觀察成瘤能力。把C6-302c-3p和C6-NC植入S-D大鼠的大腦,觀察腦內(nèi)成瘤能力。方法:構(gòu)建的慢病毒載體介導對mir-302c-3p表達,建立了2個穩(wěn)定的細胞株,分別命名為u87mg-302c-3p和u87mg-nc。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明u87mg-302c-3p細胞表達mi R-302c-3p是對照細胞u87mg-nc的15.4倍,說明建構(gòu)是成功的。然后,我們把u87mg-302c-3p和u87mg-nc細胞植入裸鼠。為了進一步探討mi R-302c-3p的抑制作用在腦腫瘤的發(fā)生,C6細胞轉(zhuǎn)染lv-302c-3P然后注入大腦。轉(zhuǎn)染LV-NC細胞作為對照組。注射后第二十一天,進行磁共振成像分析和組織病理分析。結(jié)果:(1)與U87MG-302c-3p細胞相比,小鼠腹腔注射u87mg-nc細胞形成較大的腫瘤(P=0.004)(2)與C6-302c-3p細胞相比,注射c6-nc細胞右腦形成更大的腫瘤細胞結(jié)論:(1)在膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織相比,mi R-302c-3p表達水平顯著減少。且隨著腫瘤等級的增高,表達量逐漸下調(diào),提示mi R-302c-3p與膠質(zhì)瘤惡化程度相關(guān),有可能作為膠質(zhì)瘤分級的一個標志物。正常組織相比,腫瘤組織中MTDH表達明顯上調(diào)。mi R-302c-3p與MTDH兩者之間表達呈一定的負相關(guān)性。MTDH是mi RNA-302c-3p作用的靶標蛋白。(2)轉(zhuǎn)染了LV-302c-3p的U87MG細胞增殖率減明顯減少,侵襲性U87MG細胞過量表達mi R-302c-3p的能力降低了82.4%(3)體內(nèi)成瘤的實驗證實mi R-302c-3p穩(wěn)定過表達抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的成瘤能力。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.4

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本文編號：1637547