發(fā)布時間：2018-03-19 19:32

  本文選題：非小細(xì)胞肺癌　切入點：ADAM9　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:肺癌是目前發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,且發(fā)病率呈持續(xù)增長趨勢,嚴(yán)重威脅人類健康,其中以非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)流行最廣,約占肺癌總數(shù)的80%,其發(fā)病和致死的主要原因是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移,但目前對NSCLC轉(zhuǎn)移機制尚不清楚,使得對NSCLC的預(yù)防和治療更加困難。目前對NSCLC的治療主要采用手術(shù)、放療和化療,但多數(shù)患者確診時已是晚期,失去了手術(shù)治療的最佳時機而以化療為主�；熾m然能改善晚期NSCLC患者生存期限,但由于其沒有細(xì)胞選擇性,對正常細(xì)胞的殺傷同樣嚴(yán)重,會導(dǎo)致患者免疫力下降并產(chǎn)生嚴(yán)重并發(fā)癥。因此,研究潛在NSCLC治療靶點和治療策略迫在眉睫。近幾年對分子靶向治療的研究日益深入,并逐漸應(yīng)用于癌癥的臨床治療,取得了較好的療效,為NSCLC的治療提供了新的方向。去整合素和金屬蛋白酶家族(A disintegrin and metalloproteinases,ADAMs)是一類鋅依賴性I型跨膜蛋白,具有蛋白水解酶活性和細(xì)胞粘附功能,能水解多種蛋白的胞外功能區(qū),使之脫落,從而參與調(diào)節(jié)相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。此外,ADAMs還參與降解胞外基質(zhì)、細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間粘連、細(xì)胞融合等過程,并在精卵結(jié)合、傷口愈合及腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移等病理生理過程中發(fā)揮重要作用。ADAM9作為ADAMs家族重要成員,可高表達(dá)于多種癌變組織和細(xì)胞中,并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程。研究發(fā)現(xiàn),ADAM9顯著表達(dá)于NSCLC患者中,并可導(dǎo)致患者生存期縮短;ADAM9過表達(dá)可增加NSCLC細(xì)胞粘附和侵襲能力;通過RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)使ADAM9基因沉默可抑制腺樣囊性癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移;RNAi介導(dǎo)ADAM9基因沉默可抑制A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明,ADAM9參與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)配體外功能區(qū)酶解脫落及裂解Delta-likel等過程。以上研究結(jié)果揭示,ADAM9可作為NSCLC治療的潛在靶點。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription,Stat3)是STAT家族重要成員,多種細(xì)胞因子、生長因子均可激活Stat3,并參與相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn),Stat3活化后可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、凋亡及細(xì)胞周期等;Stat3參與多個癌癥相關(guān)的酪氨酸激酶信號途徑,并高表達(dá)于多種腫瘤組織和細(xì)胞中,如前列腺癌、乳腺癌、NSCLC和卵巢癌等。Stat3的活化有利于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡,從而使癌癥惡化;而通過RNAi或小分子抑制劑抑制Stat3的表達(dá),可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;且在對NSCLC的研究中發(fā)現(xiàn),下調(diào)Stat3的表達(dá)可抑制腫瘤生長。揭示Stat3可能是NSCLC治療的潛在靶點。EGFR具有酪氨酸蛋白激酶活性,研究表明,EGFR過表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞過度生長和惡性腫瘤,Stat3是STAT家族腫瘤細(xì)胞和癌組織中表達(dá)最活躍的轉(zhuǎn)錄因子。研究證明,應(yīng)用EGFR單克隆抗體治療后,抑制Stat3的磷酸化,細(xì)胞增殖、侵襲能力降低,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,這些結(jié)果表明EGFR-STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑作用于肺癌細(xì)胞增殖過程中起到重要作用。目前實驗研究表明JAK-STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和ADAM9-EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對NSCLC發(fā)生發(fā)展起到促進(jìn)作用,兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中存在信號對答。目的:探討JAK-STAT3與ADAM9-EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在NSCLC中的關(guān)系方法:構(gòu)建ADAM9 sh RNA、Stat3 sh RNA以及對照組的慢病毒載體,并轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,從而分別獲得表達(dá)ADAM9 sh RNA慢病毒(Lv/sh-ADAM9)、Stat3 sh RNA慢病毒(Lv/sh-Stat3)或非沉默sh RNA慢病毒(Lv/sh-NC),用慢病毒Lv/sh-Stat3、Lv/sh-ADAM9、Lv/sh-NC單獨感染A549細(xì)胞,或Lv/sh-Stat3和Lv/sh-ADAM9聯(lián)合感染細(xì)胞。分別采用RT-q PCR技術(shù)和WB方法檢測細(xì)胞中Stat3和ADAM9 m RNA和蛋白表達(dá)水平。通過CCK-8方法檢測A549細(xì)胞增殖水平。TUNEL方法檢測細(xì)胞凋亡;檢測細(xì)胞caspase-3、caspase-8和caspase-9活性。細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力。Transwell方法分析細(xì)胞侵襲水平;檢測細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平。雄性BALB/c裸鼠皮下注射A549細(xì)胞以構(gòu)建NSCLC荷瘤裸鼠模型,并對荷瘤小鼠注射慢病毒Lv/sh-NC、Lv/sh-ADAM9、Lv/sh-Stat3或Lv/sh-ADAM9和Lv/sh-Stat3聯(lián)合進(jìn)行治療,對腫瘤體積及重量進(jìn)行測量;通過TUNEL方法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果:所構(gòu)建慢病毒載體經(jīng)PCR和測序鑒定無誤;重組質(zhì)粒可成功轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中;慢病毒Lv/sh Stat3和Lv/sh ADAM9可分別或者共同感染A549細(xì)胞。RNAi介導(dǎo)的Stat3或ADAM9基因沉默可分別抑制A549細(xì)胞Stat3或ADAM9 m RNA和蛋白表達(dá),二者基因共沉默同樣可抑制Stat3和ADAM9 m RNA和蛋白表達(dá)。RNAi介導(dǎo)的Stat3或ADAM9基因沉默均可抑制A549細(xì)胞的體外增殖,而二者基因共沉默在抑制細(xì)胞增殖上顯示出協(xié)同效應(yīng)。RNAi介導(dǎo)的Stat3或ADAM9基因沉默均可誘導(dǎo)A549細(xì)胞的體外凋亡,二者基因共沉默對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用更為顯著。RNAi介導(dǎo)的Stat3或ADAM9基因沉默均可抑制A549細(xì)胞體外遷移和侵襲,而二者基因共沉默對細(xì)胞侵襲顯示出協(xié)同抑制作用。RNAi介導(dǎo)的Stat3和ADAM9基因共沉默可抑制MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá),與細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化一致,揭示MMP-2和MMP-9參與A549細(xì)胞的體外遷移和侵襲。RNAi介導(dǎo)的體內(nèi)Stat3或ADAM9基因沉默可抑制NSCLC腫瘤組織生長,二者基因共沉默對腫瘤組織生長的抑制作用更強。結(jié)論:ADAM9和Stat3基因共沉默可協(xié)同抑制體外NSCLC增殖、遷移和侵襲能力,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,能夠協(xié)同抑制體內(nèi)腫瘤生長。JAK-STAT3與ADAM9-EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在NSCLC發(fā)生發(fā)展過程中起協(xié)同作用。Stat3不是JAK-STAT3與ADAM9-EGFR兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的共同關(guān)鍵節(jié)點。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：1635688