本文選題：散發(fā)性結(jié)直腸癌　切入點：全外顯子組測序　出處：《西北大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景：散發(fā)性結(jié)直腸癌(sporadic colorectal cancer, sCRC)是由大腸粘膜上皮起源的惡性腫瘤,其患病比例約占結(jié)直腸癌(Colorectal cancer, CRC)的70%,是我國常見的五大惡性腫瘤之一。近年來,CRC的患病率及死亡率上升趨勢不減,嚴(yán)重威害大眾的健康。從分子水平上看,研究已報道的sCRC標(biāo)識物主要集中在APC, KRAS及TP53基因等以及圍繞這些基因展開的系統(tǒng)功能及分子機(jī)制研究。然而這些已報道的基因?qū)CRC發(fā)生的解釋度仍有限。隨著組學(xué)時代的到來,系統(tǒng)地從全基因組范圍內(nèi)篩查并確定sCRC新的候選基因,有助于我們進(jìn)一步認(rèn)知其發(fā)病的分子發(fā)病機(jī)制。全外顯子組測序技術(shù)的出現(xiàn),以及測序成本的逐漸降低,使我們從海量人類基因組變異數(shù)據(jù)中篩選與疾病相關(guān)變異基因成為可能。相比于測序,更重要的是如何從這些數(shù)據(jù)中快速準(zhǔn)確地挖掘出我們感興趣的候選基因,而這些基因在研究模型中處于怎樣的地位,也是要深入挖掘的。研究方法：1、我們首先從3例中國漢族sCRC癌組織樣本入手,通過全外顯子組測序技術(shù)及數(shù)據(jù)質(zhì)控分析,結(jié)合基于功能缺失(Loss of Function)突變的篩查策略以及自身組織-血液樣本一代重測序驗證,確定新的sCRC癌組織特異LoF突變位點。結(jié)合相關(guān)生物信息分析,確定具有抑癌或錯配修復(fù)功能的候選基因。2、從DNA突變,RNA及蛋白表達(dá)水平深入研究候選基因是否在sCRC臨床樣本中發(fā)生顯著性改變。在100-110例獨立樣本中對候選基因的編碼區(qū)進(jìn)行深度測序,統(tǒng)計突變頻率；收集獲取28例sCRC癌組織及正常組織RNA,利用實時定量熒光PCR驗證候選基因在兩組間的表達(dá)差異；對可能的候選基因利用組織芯片的免疫組化確定其在sCRC癌組織及癌旁正常組織中的蛋白表達(dá)差異。系統(tǒng)綜合分析這三種不同水平的信息結(jié)果,確定可能作為sCRC的新抑癌基因。最終確定骨形態(tài)發(fā)生蛋白5(BMP5)為sCRC高可信抑癌基因。3、通過體外細(xì)胞實驗觀察BMP5的缺失和獲得對CRC細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響,體內(nèi)裸鼠成瘤實驗進(jìn)一步探討B(tài)MP5對腸癌細(xì)胞裸鼠成瘤的影響。4、通過轉(zhuǎn)錄組測序確定BMP5可能影響的下游差異表達(dá)基因,深度分析BMP5在腸癌模型中的功能表型。確定BMP5是通過何種信號途徑影響重要的下游基因進(jìn)而參與CRC的發(fā)生、發(fā)展。結(jié)果：1、利用全外顯子組測序技術(shù),經(jīng)數(shù)據(jù)質(zhì)控篩查分析確定3例sCRC癌組織特異的LoF突變基因共72個。通過生物信息數(shù)據(jù)庫查詢、基因功能分析確定可能具有抑癌或錯配修復(fù)作用的重要基因5個：BMP5、DDI2、RASSF6、SARDH, C9orf9。2、臨床樣本編碼區(qū)深度測序發(fā)現(xiàn)BMP5的突變頻率最高,為7.7%(8/104),其中7例為致病性突變；28例成對樣本的RNA水平表達(dá)顯示,BMP5在sCRC癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁正常組織(P0.0001),其中下調(diào)差異倍數(shù)在1.5倍以上的23例(82.1%,23/28),平均下調(diào)差異倍數(shù)5.72倍。129例成對樣本的免疫組化研究確定BMP5在正常腸組織中的陽性表達(dá)顯著高于癌組織(89.1% vs 75.2%,P=0.0053)。BMP5的表達(dá)與患者的性別、年齡以及病理分期均無相關(guān)性。綜合以上幾個方面的分析,我們認(rèn)為BMP5的高突變率及低表達(dá)率,是其作為sCRC新候選抑癌基因的可靠依據(jù)。3、體外細(xì)胞水平實驗顯示,BMP5的獲得及缺失能夠影響CRC細(xì)胞系HT-29及SW480的增殖能力,但這種增殖能力的影響可能不是因細(xì)胞凋亡所引起。SW480細(xì)胞系中BMP5的缺失能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力,但BMP5的獲得對其影響不顯著,尤其是細(xì)胞侵襲實驗。體內(nèi)裸鼠成瘤實驗顯示,過表達(dá)BMP5的HT-29在裸鼠體內(nèi)的成瘤速度要顯著低于對照組(P=0.033)。4、轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果顯示,在HT-29細(xì)胞系中BMP5的表達(dá)上調(diào)可引起基因組內(nèi)366個基因的差異表達(dá),其中主要表現(xiàn)為下游基因的表達(dá)抑制。信號通路及共表達(dá)分析的結(jié)果顯示BMP5可能通過Jak-STAT信號通路抑制EPSTI1(epithelial stromal interaction 1)的表達(dá)。結(jié)論：基于LoF突變的篩查策略可以快速的尋找與腫瘤發(fā)生相關(guān)的重要突變基因。臨床樣本中BMP5的突變及其低表達(dá)可能作為sCRC組織特異的標(biāo)識物。BMP5在CRC模型中能夠抑制細(xì)胞的增殖及遷移、侵襲行為,具有抑癌作用。BMP5可能存在非Smad依賴的信號通路,即通過Jak-STAT通路影響EPSTI1的表達(dá)改變,暗示BMP5的表達(dá)異�？赡苁莝CRC發(fā)生的早期事件,這一結(jié)果在先前并未見報道。本課題運用組學(xué)的角度系統(tǒng)挖掘sCRC潛在的分子標(biāo)識,為sCRC發(fā)病的分子機(jī)理提供新的證據(jù)及理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Worrawit Wanitsuwan;Samornmas Kanngurn;Teeranut Boonpipattanapong;Rassamee Sangthong;Surasak Sangkhathat;;Overall expression of beta-catenin outperforms its nuclear accumulation in predicting outcomes of colorectal cancers[J];World Journal of Gastroenterology;2008年39期

，

本文編號：1631582