本文選題：KCTD12　切入點(diǎn)：OCM-1　出處：《吉林大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：人類鉀離子通道四聚體結(jié)構(gòu)域蛋白12(KCTD12,也稱為Pfetin)是KCTD家族26個(gè)成員之一。KCTD12調(diào)節(jié)GABAB受體信號(hào)的激動(dòng)劑效力和動(dòng)力學(xué)效應(yīng)。蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明KCTD12可能是判斷胃腸道間質(zhì)瘤預(yù)后潛在的生物標(biāo)志物。然而,很少有報(bào)道關(guān)于KCTD12對(duì)其他腫瘤類型的作用。葡萄膜黑色素瘤通常指發(fā)生在脈絡(luò)膜,睫狀體或虹膜上的黑色素瘤。葡萄膜黑色素瘤是最常見(jiàn)的成人原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤。在美國(guó),這些癌癥的發(fā)生率是5%,其中85%是葡萄膜原發(fā)。葡萄膜黑色素瘤患者早期表現(xiàn)為無(wú)痛性視力下降,后期則可導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離。此外,葡萄膜黑色素瘤具有高度轉(zhuǎn)移性,患者黑色素瘤可能轉(zhuǎn)移到肝臟,肺或者皮膚。因此,葡萄膜黑色素瘤患者有高達(dá)一半的死亡率。葡萄膜黑色素瘤腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移是復(fù)雜過(guò)程。到目前為止,尚無(wú)研究KCTD12對(duì)葡萄膜黑素瘤影響的相關(guān)研究。本課題研究旨在探討過(guò)表達(dá)KCTD12基因?qū)γ}絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞OCM-1的生物學(xué)功能的影響。本研究設(shè)計(jì)并亞克隆KCTD12全長(zhǎng)和部分片段基因。構(gòu)建了真核過(guò)表達(dá)載體PC3.1-KCTD12,瞬轉(zhuǎn)人類脈絡(luò)膜黑素瘤細(xì)胞系(OCM-1),發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)KCTD12可以上調(diào)腫瘤上皮組織標(biāo)志蛋白E-cad的表達(dá)及降低腫瘤上皮組織間質(zhì)化(EMT)標(biāo)志蛋白Vimitin的表達(dá)。構(gòu)建慢病毒核心質(zhì)粒p LVX-Puro-KCTD12,篩選出穩(wěn)定表達(dá)KCTD12的OCM-1細(xì)胞系。我們將得到的細(xì)胞系進(jìn)行RNA-Sequencing檢測(cè),并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)水平變化主要包括增殖,細(xì)胞黏附,細(xì)胞凋亡,血管生成等方面。我們也針對(duì)以上結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。通過(guò)MTS實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)及軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明KCTD12可有效抑制OCM-1細(xì)胞的增殖。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell侵襲遷移實(shí)驗(yàn)及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)上皮化標(biāo)志物E-cadherin,β-Catenin表達(dá)量上調(diào),而間質(zhì)化標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)量則下降,Snail及slug作為E-cadherin的調(diào)節(jié)因素,表達(dá)量也有所下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)KCTD12可以限制OCM-1細(xì)胞的侵襲及遷移。通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期及凋亡進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)的關(guān)健蛋白進(jìn)行檢測(cè)。蛋白檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)cyclin B表達(dá)量明顯下降。結(jié)果表明過(guò)表達(dá)KCTD12的OCM-1細(xì)胞中G2/M到G1期的過(guò)程時(shí)間延長(zhǎng)。另外,KCTD12過(guò)表達(dá)OCM-1細(xì)胞抑制了裸鼠體內(nèi)異種移植物的生長(zhǎng)。最后,實(shí)驗(yàn)還構(gòu)建了PGEX-4T-KCTD12全長(zhǎng)和部分片段的載體,進(jìn)行原核表達(dá),并純化了帶GST及HIS標(biāo)簽的KCTD12全長(zhǎng)及部分片段的融合蛋白。用全長(zhǎng)部分蛋白驗(yàn)證對(duì)OCM-1細(xì)胞的生物學(xué)作用,并用部分片段蛋白免疫小鼠制備了鼠源性抗體。總的來(lái)說(shuō),過(guò)表達(dá)KCTD12具有抑制OCM-1細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,未來(lái)有可能作為治療脈絡(luò)膜黑色素瘤的新型治療靶標(biāo)。
[Abstract]:Human potassium channel tetramer domain protein 12KCTD12, also known as Pfetinin, is one of the 26 members of the KCTD family. KCTD12 regulates the agonist potency and kinetic effects of GABAB receptor signal. Proteomics analysis indicates that KCTD12 may be the judge of gastrointestinal tract. Potential biomarkers for tumor prognosis. However, The role of KCTD12 in other types of tumors is rarely reported. Uveal melanoma usually refers to melanoma occurring in the choroid, ciliary body, or iris. Uveal melanoma is the most common primary intraocular malignant tumor in adults. The incidence of these cancers is 5%, of which 85% are primary uveal. Patients with uveal melanoma show painless visual acuity at an early stage, which can lead to retinal detachment later. In addition, uveal melanoma is highly metastatic. Patients with melanoma may metastasize to the liver, lungs, or skin. As a result, uveal melanoma patients have a high rate of death. The occurrence and metastasis of uveal melanoma tumors is a complex process. No study has been done on the effect of KCTD12 on uveal melanoma. This study aims to investigate the effect of overexpression of KCTD12 gene on the biological function of OCM-1 in choroidal melanoma cells. This study designed and subcloned the full length and part of KCTD12. Fragment gene. Eukaryotic expression vector PC3.1-KCTD12 was constructed and transformed into human choroidal melanoma cell line (OCM-1). It was found that overexpression of KCTD12 could up-regulate the expression of E-cad, and decrease the expression of mesenchymal marker of tumor epithelium. Construction of lentivirus core plasmid pLVX-Puro-KCTD12 and screening of OCM-1 cell lines stably expressing KCTD12. The obtained cell lines will be detected by RNA-Sequencing. Bioinformatics analysis of the data shows that the changes of gene expression level mainly include proliferation, cell adhesion, apoptosis, angiogenesis and so on. The results of plate cloning and soft Agar cloning showed that KCTD12 could effectively inhibit the proliferation of OCM-1 cells, and the expression of E-cadherin and 尾 -Catenin was up-regulated by scratching test, transwell invasion and migration assay and the expression of related proteins. However, the expression of interstitial marker Vimentin decreased. Snail and slug were the regulatory factors of E-cadherin. The results showed that overexpression of KCTD12 could limit the invasion and migration of OCM-1 cells. Flow cytometry was used to detect cell cycle and apoptosis. The results showed that the expression of cyclin B was significantly decreased. The results showed that the process time from G2 / M to G1 phase was prolonged in OCM-1 cells with overexpression of KCTD12. In addition, KCTD12 over-expressed OCM-1 cells. Inhibit the growth of xenografts in nude mice. Finally, The full-length and partial fragments of PGEX-4T-KCTD12 were constructed and expressed in prokaryotic expression, and the fusion proteins of KCTD12 with GST and HIS tags were purified. The biological effects on OCM-1 cells were verified by full-length partial proteins. In general, overexpression of KCTD12 could inhibit the growth of OCM-1 cells and might be a new therapeutic target for choroidal melanoma in the future.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.7

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本文編號(hào)：1631111