本文選題：表阿霉素　切入點：兩親性嵌段共聚物　出處：《吉林大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：原發(fā)性肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,在腫瘤導致的死亡原因中占第3位,對經(jīng)濟發(fā)展及相關人群的生活質(zhì)量造成了極大的負面影響。肝切除是肝癌治療的首選方案,能夠有效的提高患者的生活質(zhì)量及延長生存期。但是由于其起病隱匿、發(fā)展迅速,絕大多數(shù)肝癌患者診斷時已處于疾病的中晚期,而失去了接受手術治療的機會。作為另外一種可能治愈肝癌的手段,肝移植由于肝源匱乏、費用較高等原因很難惠及多數(shù)患者。化療在腫瘤的治療中有著重要的地位,但傳統(tǒng)化療藥物具有組織分布特異性差、循環(huán)半衰期短等缺陷,使其難以在腫瘤部位保持有效的藥物濃度,加之多數(shù)肝癌對細胞毒性藥物不敏感,從而導致難以達到理想的治療效果。另外,難以耐受的毒副作用也是限制傳統(tǒng)化療藥物應用的重要原因。納米載藥系統(tǒng)在臨床領域的應用為克服傳統(tǒng)化療藥物的缺陷及提高化療療效提供了新的方向。尤其是生物相容性良好且可修飾性強的聚合物納米載體,可實現(xiàn)藥物的靶向輸送及智能釋放,有望顯著改善傳統(tǒng)化療藥物的藥代動力學特性并延長其循環(huán)半衰期。以聚氨基酸為基礎的兩親性共聚物更是以其可控的生物可降解性及巧妙的二級結構,成為聚合物納米載體構建的理想選擇。本研究以傳統(tǒng)的肝癌化療藥表阿霉素(EPI)及合成的聚乙二醇-block-聚(L-谷氨酸)(m PEG-b-PGA)為基礎,成功構建了載EPI納米膠束,并通過體內(nèi)外的各種實驗手段證實其在肝癌治療的優(yōu)勢。具體實驗內(nèi)容如下。第一部分:p H敏感的負載EPI的聚乙二醇-block-聚谷氨酸(m PEG-b-PGA/EPI)膠束的制備、表征及細胞內(nèi)藥物傳輸。本研究(1)首先以端氨基聚乙二醚單甲醚作為大分子引發(fā)劑,引發(fā)L-谷氨酸芐酯-N-羧酸酐發(fā)生開環(huán)聚合反應,并對所獲取的產(chǎn)物進行脫芐酯保護最終得到了兩親性的m PEG-b-PGA。應用核磁共振氫(1H NMR)譜和傅里葉變換紅外色譜(FT-IR)對上述材料的化學結構進行表征,結果顯示我們成功合成了該共聚物。然后應用透析法,利用m PEG-b-PGA共聚物與EPI間的靜電相互作用,合成了載EPI的聚合物膠束m PEG-b-PGA/EPI,動態(tài)激光光散射(DLS)及透射電子顯微鏡(TEM)檢測結果顯示該膠束呈現(xiàn)為大小在80-90nm左右的規(guī)則球形,符合實體腫瘤滲透與滯留增強(EPR)效應對納米顆粒的粒徑要求。經(jīng)測定m PEG-b-PGA/EPI的載藥率及載藥效率分別為14.68 wt.%和72.50 wt.%,說明以聚氨基酸為基礎的兩親性共聚物膠束能夠高效的負載疏水性的傳統(tǒng)化療藥物。后續(xù)進行的體外釋放實驗證實m PEG-b-PGA/EPI具有良好的緩釋及p H敏感的智能釋放功能。(2)應用激光共聚焦顯微鏡及流式細胞儀檢測m PEG-b-PGA/EPI的Hep G2肝癌細胞的攝取情況,結果顯示載藥膠束能夠有效的進入細胞,并且隨著時間的延長,其在細胞內(nèi)的積累量逐漸接近游離EPI。應用MTT實驗檢測材料及m PEG-b-PGA/EPI的對肝癌細胞Hep G2毒性,結果顯示m PEG-b-PGA材料具有良好的組織相容性,即使在100μg/m L的高濃度條件下作用72 h,細胞仍保持了90%以上的活性,而m PEG-b-PGA/EPI則表現(xiàn)出了典型的時間及濃度依賴性的肝癌細胞活性抑制作用。第二部分:m PEG-b-PGA/EPI的毒理分析及組織分布。為了評估本研究中合成的載藥納米膠束的體內(nèi)組織相容性表現(xiàn)及對游離EPI的藥代動力學特征改善作用,我們進行了組織相容性溶血實驗、最大耐受量(MTD)實驗及體內(nèi)藥物分布檢測。m PEG-b-PGA/EPI最終將通過靜脈注射的方式給藥,因此良好的血液相容性是其進一步應用的重要基礎。在本研究的溶血實驗中,大劑量的m PEG-b-PGA(5 mg/m L)也未引起明顯的溶血反應。而且m PEG-b-PGA包裝能夠降低高濃度游離EPI的溶血危險性。進一步的MTD實驗證實m PEG-b-PGA的包載對游離EPI的機體毒性具有良好的改善作用,能有效的提高藥物的應用劑量。應用小鼠皮下肝癌模型進行的體內(nèi)藥物組織分布實驗結果顯示,與游離EPI相比,m PEG-b-PGA/EPI具有顯著增強的腫瘤內(nèi)藥物蓄積作用,可能提示其會產(chǎn)生更佳的抗肝癌療效。第三部分:m PEG-b-PGA/EPI的體內(nèi)抗肝癌療效及安全性研究。提高傳統(tǒng)化療藥物的抗腫瘤療效并降低其副作用是納米藥物載體設計的最終目的。本研究選取了小鼠肝癌細胞H22作為瘤源,構建了BALB/c小鼠肝癌皮下模型,作為m PEG-b-PGA/EPI對EPI抗腫瘤療效影響的評價工具。分別應用8 mg/kg的EPI、相當藥物劑量的m PEG-b-PGA/EPI及相應m PEG-b-PGA/EPI組內(nèi)材料劑量的m PEG-b-PGA對肝癌小鼠模型進行靜脈給藥治療,并以生理鹽水注射作為陰性對照。給藥每隔3天重復一次,在為期16天的治療過程中每天定時測量腫瘤體積及小鼠體重的變化。治療結束后,處死小鼠并分離腫瘤組織及心、肝、脾、肺和腎等重要臟器并稱重,進一步應用蘇木精與伊紅(HE)染色、原位凋亡檢測及免疫熒光檢測等手段評估不同治療手段引起的臟器損傷、腫瘤組織壞死和凋亡情況。在抗肝癌療效方面,雖然兩種藥物治療均顯示出了抑制腫瘤生長的作用,但借助自身的緩釋、p H敏感的智能釋放特性及實體腫瘤的EPR效應,與游離EPI組相比,m PEG-b-PGA/EPI治療顯示出了顯著增強的療效,m PEG-b-PGA/EPI組的腫瘤抑制率、腫瘤指數(shù)均顯著優(yōu)于EPI組。HE染色及原位凋亡檢測結果進一步明確了上述優(yōu)勢,肝癌壞死面積及凋亡細胞平均熒光強度統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示m PEG-b-PGA/EPI能夠顯著增強EPI引起的腫瘤細胞壞死及凋亡程度。同時,本研究應用免疫熒光技術檢測了各治療組腫瘤組織裂解的Caspase-3及Ki-67的表達情況,上述兩種蛋白在m PEG-b-PGA/EPI組及EPI組的平均熒光強度分別為2.60±0.49%、0.67±0.19%和1.75±0.41%、0.40±0.13%,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),該結果從另外一個側(cè)面反映了m PEG-b-PGA/EPI對EPI誘導腫瘤細胞凋亡及抑制增殖的增強作用。安全性方面,m PEG-b-PGA材料的反復應用未引起模型小鼠體重、臟器指數(shù)及臟器病理學檢測相對于對照組的明顯改變,再次證明了m PEG-b-PGA良好的組織相容性及作為藥物載體的可行性。雖然兩種劑型的藥物均引起了不同程度的模型小鼠體重的降低及臟器的損傷,但m PEG-b-PGA/EPI的傷害程度更低。更有意義的是,m PEG-b-PGA/EPI顯著改善了EPI組模型小鼠肝臟及脾臟指數(shù)降低的情況。綜上所述,在生物相容性良好的m PEG-b-PGA聚合物基礎上,本研究合成的載EPI膠束m PEG-b-PGA/EPI能夠顯著增強EPI的肝癌治療效果并降低其副作用,具有優(yōu)異的醫(yī)學應用前景。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

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本文編號：1620552