發(fā)布時間：2018-03-16 11:22

  本文選題：聯(lián)苯二氟酮　切入點：葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景肺癌(lung cancer)是一種嚴(yán)重危害人類生命健康的主要惡性腫瘤,在全球范圍內(nèi)其死亡率位列惡性腫瘤首位,并且近年來其發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢。肺癌中以非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)居多,占80%-85%,治療的手段主要是手術(shù)、放療、化療和分子靶向治療為主的綜合治療。NSCLC的病因尚未明確,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,是多種因素共同作用的結(jié)果,已有研究表明空氣污染、吸煙等環(huán)境因素以及遺傳因素與其發(fā)病有關(guān)。近年來,國內(nèi)外學(xué)者從不同角度探討NSCLC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌的癌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),這一點與正常細(xì)胞不同,而這一特性的獲得與癌細(xì)胞對葡萄糖的攝取以及糖酵解代謝的增強(qiáng)有關(guān)。葡萄糖攝取量的增加和糖酵解能量代謝的增強(qiáng)不僅可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、浸潤和轉(zhuǎn)移,而且還造成后期對放療、化療等治療方法的抵抗,所以傳統(tǒng)的腫瘤治療方式很難達(dá)到理想的效果。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(glucose transport protein, GLUT)是嵌入在細(xì)胞膜上,轉(zhuǎn)運葡萄糖的載體蛋白,在正常生理條件下葡萄糖需借助GLUT而被細(xì)胞所攝取。該家族的主要成員葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1 (glucose transporter protein 1, GLUT1)是細(xì)胞糖代謝的主要限速蛋白,是體內(nèi)分布最廣的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白,幾乎在所有的腫瘤組織中均存在過度表達(dá)。GLUT1的過度表達(dá)使腫瘤細(xì)胞在缺血、缺氧的情況下得以高效攝取和利用葡萄糖,從而獲得更多的能量供應(yīng),以維持腫瘤細(xì)胞快速生長。研究表明NSCLC細(xì)胞的惡性增殖和侵襲轉(zhuǎn)移性能與GLUT1的過度表達(dá)密切相關(guān),而且與腫瘤的大小、分化程度、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。姜黃素(curcumin)是從姜黃屬植物姜黃、郁金、莪術(shù)等的根或莖中提取的一種有效植物多酚,它具有抗菌、抗病毒、抗氧化和抗炎癥反應(yīng)的多重生物學(xué)效應(yīng)。2004年Adams等人在姜黃素分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,發(fā)現(xiàn)了一百多種姜黃素衍生物,它們大部分都具有抗腫瘤的作用機(jī)制,其中聯(lián)苯二氟酮(Diphenyl difluoroketone, EF-24)的作用最為顯著。研究發(fā)現(xiàn)EF-24對大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞株,與胃癌、腸癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌及卵巢癌等相關(guān),都有明顯的抑制作用,其效果至少是姜黃素的10余倍。EF-24在治療前列腺癌和乳腺癌時可以直接抑制低氧誘導(dǎo)因子-1α (hypoxia induce factor-1 a, HIF-1α)的轉(zhuǎn)錄活性,從而使腫瘤細(xì)胞中HIF-1 a介導(dǎo)的調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白和糖酵解酶的相關(guān)基因上調(diào),促使腫瘤在低氧時采用糖酵解途徑。并且EF-24在卵巢癌細(xì)胞研究中可以抑制GLUT1介導(dǎo)的代謝,從而抑制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移。鑒于此,我們設(shè)想以GLUT1為切入點,利用Western-blotting、RT-PCR檢測EF-24對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞GLUT1蛋白及基因的影響；觀察EF-24在不同濃度對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖活性的影響；利用Trans well細(xì)胞侵襲實驗以及建立裸鼠皮下移植瘤的動物模型,通過體內(nèi)和體外實驗觀察EF-24對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響；通過觀察EF-24在細(xì)胞水平、機(jī)體水平對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖活性以及糖酵解中糖代謝和GLUT1表達(dá)的影響,研究EF-24與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移的關(guān)系,為有效防治非小細(xì)胞肺癌提供藥物治療的新靶點。目的：1.明確NSCLC患者的肺部癌組織、癌旁組織以及正常肺組織中GLUT1的轉(zhuǎn)錄水平以及翻譯水平的表達(dá)情況；2.以GLUT1為切入點,不同濃度的EF-24處理NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞,通過MMT實驗明確EF-24對A549細(xì)胞增殖活性的影響；3.研究EF-24與NSCLC的侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系,為有效防治肺癌提供藥物治療新靶點。方法：1.收集NSCLC患者的臨床新鮮手術(shù)組織標(biāo)本,如正常組織標(biāo)本、成對肺癌組織、癌旁組織。所取臨床標(biāo)本經(jīng)山東大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會審計批準(zhǔn)。2.應(yīng)用蛋白印跡實驗、免疫組化的方法來明確NSCLC組織結(jié)構(gòu)中GLUT1的表達(dá)情況,并結(jié)合臨床病理結(jié)果分析GLUT1的表達(dá)與NSCLC臨床病理分級的關(guān)系。3.利用不同濃度的EF-24處理NSCLC A549細(xì)胞系,應(yīng)用RT-PCR、免疫印跡、熒光報告分析等實驗來明確GLUT1在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)情況,并結(jié)合細(xì)胞周期分析、細(xì)胞遷移實驗、體內(nèi)成瘤實驗、MTT法測定細(xì)胞增殖活性等方法進(jìn)一步評估此現(xiàn)象。4.應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)、細(xì)胞計數(shù)、檢測細(xì)胞增殖實驗的方法,通過細(xì)胞體外、裸鼠體內(nèi)2種實驗來分析GLUT1對A549細(xì)胞系的生長增殖能力的影響。5.統(tǒng)計學(xué)分析：實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS16.0進(jìn)行分析統(tǒng)計。符合正態(tài)分布的數(shù)值變量資料應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(x±s)。兩組之間的統(tǒng)計學(xué)比較應(yīng)用t-test,多組之間等級資料的統(tǒng)計學(xué)比較采用方差分析、Tukey檢驗。P值0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果：1.在患者肺組織標(biāo)本中,通過RT-PCR、免疫印跡技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)與對應(yīng)的癌旁組織、正常肺組織比較,肺腫瘤組織中GULT1的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平均明顯上調(diào),并與腫瘤的臨床病理分級呈正相關(guān)關(guān)系。2.本研究通過在A549細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染GLUT1 siRNA及shRNA將GLUT1基因沉默,并經(jīng)細(xì)胞計數(shù)、檢測細(xì)胞的增殖實驗方法,證實了GLUT1基因的沉默能夠引起A549細(xì)胞的生長和增殖能力減低。另外,通過在裸鼠的體內(nèi)實驗,A549細(xì)胞被轉(zhuǎn)染GLUT1 shRNA注射入裸鼠體內(nèi),7周后發(fā)現(xiàn)與對照組比較,腫瘤的體積明顯縮小,這進(jìn)一步證實沉默GLUT1基因可以顯著抑制肺癌細(xì)胞的生長。因此,我們認(rèn)為GLUT1被沉默后A549細(xì)胞的生長和成瘤能力均受到顯著抑制,從而反向證明了GLUT1促進(jìn)A549細(xì)胞系的生長增殖能力。3.利用不同濃度EF-24處理A549細(xì)胞,通過免疫印跡技術(shù),結(jié)果表明在A549細(xì)胞中的EF-24可以顯著減少GLUT1的表達(dá),并且這種下降呈明顯的梯度依賴性,與EF-24的藥物濃度成正比。4.通過采用不同濃度的EF-24分別處理A549細(xì)胞,檢測A549細(xì)胞中葡萄糖的吸收和糖酵解的速度、觀察Transwell細(xì)胞遷移、侵襲及用MTT檢測細(xì)胞增殖能力,我們發(fā)現(xiàn)EF-24可以抑制A549細(xì)胞的糖酵解途徑及抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲。結(jié)論：1.本實驗發(fā)現(xiàn)GLUT1在非小細(xì)胞肺癌組織的表達(dá)顯著高于相鄰癌旁組織和正常的肺組織；2.本研究證明EF-24可以抑制GLUT1基因在A549細(xì)胞系的表達(dá),從而影響NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞的糖酵解途徑及遷移侵襲,進(jìn)而抑制NSCLC的生長；3.姜黃素類似物EF-24為肺癌的藥物治療提供了一個新的選擇。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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1 張穎;GLUT1介導(dǎo)EF-24抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長的機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2016年

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本文編號：1619699