本文選題：腎細(xì)胞癌　切入點：p38IP　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是成人泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,在所有人類惡性腫瘤中,其所占比率約為2%-3%;在腎臟系統(tǒng)的惡性腫瘤中,其約占80-90%[1],腎細(xì)胞癌在我國泌尿系腫瘤中的發(fā)病率僅次于膀胱癌。腎細(xì)胞癌起源于腎臟實質(zhì)的腎小管上皮,其生物學(xué)行為及其特征較為復(fù)雜,其發(fā)生發(fā)展的機制尚未完全明確,其具有較高的惡性程度,臨床資料顯示,25%-30%初次就診即確診腎細(xì)胞癌的患者已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移[2]。對于那些初次診斷為局限性腎癌的患者,在進(jìn)行根治性手術(shù)后的10年內(nèi)仍有30%的轉(zhuǎn)移風(fēng)險。目前,外科手術(shù)是根治腎細(xì)胞癌的主要方法,但那些已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移的腎細(xì)胞癌患者,則無法接受根治性手術(shù)治療。此外,對于中晚期腎癌患者,盡管隨著近年來生物靶向治療、免疫治療等新的治療手段的不斷應(yīng)用,能在某種程度上延長患者生存期,但大多數(shù)病人仍難免死于腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移,其5年生存率往往小于10%[3]。因此,探索腎細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制,尋找有效的生物學(xué)標(biāo)記物,仍然具有很強的現(xiàn)實意義,以期為腎細(xì)胞癌的生物治療提供新的治療思路。p38結(jié)合蛋白p38IP(p38-interacting protein)是被研究者發(fā)現(xiàn)的一種能直接與p38結(jié)合的蛋白,并且能夠參與p38 MAP激酶的激活過程[4]。Uta Schmidt等[5]通過對61例前列腺癌及癌旁正常腺體標(biāo)本進(jìn)行qPCR檢測,結(jié)果顯示61例前列腺癌標(biāo)本中中46%呈現(xiàn)p38IPmRNA低表達(dá)1.5倍以上,28%的標(biāo)本例數(shù)呈現(xiàn)mRNA高表達(dá)1.5倍以上。p38IP可以通過通過與p38的相互作用,下調(diào)E-cadherin(鈣黏蛋白)參與哺乳動物原腸胚的形成過程,并且p38IP與p38的這種相互作用是下調(diào)E-cadherin所必須的,否則將會導(dǎo)致原腸胚發(fā)育缺陷[3]。另有報道發(fā)現(xiàn),細(xì)胞在饑餓條件下,p38IP可與自噬相關(guān)蛋白Atg9的相互作用,并參與Atg9所介導(dǎo)的信號通路和自噬體的形成[6]。有關(guān)p38IP的研究目前屈指可數(shù),有關(guān)其與腫瘤關(guān)系的研究,目前更是鮮見報道。研究目的探尋p38IP在腎癌組織、腎癌細(xì)胞株中的表達(dá);通過體內(nèi)及體外實驗研究p38IP在腎癌細(xì)胞株中的細(xì)胞生物學(xué)功能;探討p38IP對腎癌細(xì)胞生物學(xué)作用的可能相關(guān)機制。方法通過免疫印記法及qPCR技術(shù)探尋p38IP在腎臟腫瘤、正常腎臟組織、正常腎小管上皮細(xì)胞株以及腎癌細(xì)胞株中mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。通過生長曲線、細(xì)胞劃痕試驗、平板克隆形成實驗檢測了穩(wěn)定表達(dá)及干擾p38ip對腎癌細(xì)胞株生物學(xué)的影響。balb/c-nu裸鼠移植瘤模型,觀察p38ip在體內(nèi)實驗中的生物學(xué)效應(yīng)。采用饑餓方法誘導(dǎo)自噬,觀察p38ip對腎癌細(xì)胞自噬活性的影響。分子機制的初步探討:利用免疫印跡法研究p38ip對細(xì)胞周期蛋白以及pi3k/akt/mtor信號通路相關(guān)信號分子的影響,初步探討p38ip調(diào)控細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞自噬的可能分子機制。主要結(jié)果腎透明細(xì)胞癌組織p38ipmrna呈現(xiàn)低表達(dá)趨勢,p38ip蛋白水平呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢。人正常腎小管上皮細(xì)胞株hk-2相比,腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株os-rc-2及786-omrna水平低表達(dá);蛋白水平,os-rc-2細(xì)胞株表現(xiàn)為p38ip低表達(dá),786-o細(xì)胞株為高表達(dá)。慢病毒成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)pbob-gfp及pbob-p38ip的os-rc-2細(xì)胞株。p38ip參與調(diào)控腎癌細(xì)胞增殖,穩(wěn)定表達(dá)p38ip能夠顯著抑制os-rc-2細(xì)胞株的增殖能力,表現(xiàn)為生長曲線受到抑制,單細(xì)胞集落形成能力顯著降低,細(xì)胞周期分布顯示超表達(dá)p38ip后os-rc-2細(xì)胞株g2/m期阻滯。體內(nèi)實驗進(jìn)一步證實在os-rc-2細(xì)胞株中超表達(dá)p38ip導(dǎo)致裸鼠移植瘤生長受到抑制,表現(xiàn)為瘤體生長顯著減慢,最終收獲的瘤體更小。但是在另外一株腎癌細(xì)胞株786-o中,應(yīng)用sirna技術(shù)瞬時干擾p38ip的表達(dá)亦顯著抑制該細(xì)胞株的生長曲線。western-blot檢測顯示,穩(wěn)定表達(dá)p38ip后能夠顯著增強饑餓誘導(dǎo)的os-rc-2細(xì)胞自噬,在通過sirna干擾p38ip的表達(dá)則顯著抑制786-o細(xì)胞自噬。在os-rc-2細(xì)胞株中超表達(dá)p38ip能加快cyclina的降解,但同時也延緩了cyclinb的降解速度,在os-rc-2細(xì)胞株中超表達(dá)p38ip反而檢測到了p38的磷酸化水平異常增強,這可能是其延緩cyclinb降解的機制之一。而在786-o細(xì)胞株中應(yīng)用sirna干擾p38ip能夠顯著減慢細(xì)胞周期蛋白cyclina及cyclinb的降解。p38ip參與調(diào)控pi3k/akt/pmtor信號通路,可能是其參與調(diào)控自噬的潛在機制。穩(wěn)定表達(dá)p38ip的os-rc-2細(xì)胞株,其pi3k/akt/mtor信號通路受到抑制,表現(xiàn)為p85表達(dá)量降低,akt及mtor磷酸化水平降低,而在786-o細(xì)胞中干擾p38ip后pi3k/akt/mtor信號通路則激活。p38ip負(fù)性調(diào)控腎癌細(xì)胞株os-rc-2中pi3kc3蛋白含量,并且p38ip蛋白分別與pi3kc3和beclin1蛋白存在相互作用。主要結(jié)論1、p38ip在腎癌組織中呈現(xiàn)蛋白水平的高表達(dá)趨勢和mrna水平的低表達(dá)趨勢,在腎癌細(xì)胞株中蛋白水平表達(dá)不一致,mrna呈現(xiàn)低水平表達(dá)。2、p38ip參與調(diào)控腎癌細(xì)胞株增殖能力,超表達(dá)p38ip可以導(dǎo)致os-rc-2細(xì)胞細(xì)胞周期G2/M期阻滯,超表達(dá)p38IP可以促進(jìn)腎癌細(xì)胞株OS-RC-2細(xì)胞株遷移;干擾p38IP抑制786-O增殖。3、p38IP通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白Cyclin A和Cyclin B的降解是其參與調(diào)節(jié)腎癌細(xì)胞株OS-RC-2及786-O增殖能力的潛在機制之一。4、p38IP負(fù)向調(diào)節(jié)腎癌細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號通路。5、p38IP促進(jìn)由饑餓誘導(dǎo)的腎癌細(xì)胞OS-RC-2自噬,這種自噬調(diào)節(jié)具有mTOR依賴性。6、p38IP負(fù)向調(diào)控PI3KC3蛋白含量,并且p38IP與PI3KC3和Beclin1存在蛋白水平的相互作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.11

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本文編號：1616191