發(fā)布時(shí)間：2016-11-01 21:37

  本文關(guān)鍵詞：腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)作用及其機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《第二軍醫(yī)大學(xué)》 2014年

腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)作用及其機(jī)制研究

劉嬌  

【摘要】：[研究背景及目的] 肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一。盡管近30年來HCC的診斷與治療已取得了較大進(jìn)展,但是其預(yù)后并未得到根本改善。因此,深入研究HCC發(fā)生、發(fā)展及其耐藥機(jī)制,尋找有效的治療靶點(diǎn)是研究人員亟需攻克的難題。 隨著腫瘤研究不斷深入,研究人員發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞并不是“孤軍奮戰(zhàn)”,他們可以招募周圍間質(zhì)細(xì)胞形成一個(gè)新的整體,我們稱之為腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)。腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM).多種間質(zhì)細(xì)胞及其分泌的蛋白組成。間質(zhì)中的細(xì)胞成分主要分為三類：血管相關(guān)細(xì)胞(angiogenic cells)、免疫細(xì)胞(immune cells)及腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(tumor associated fibroblasts,TAFs)。越來越多的研究表明TAFs參與維持腫瘤的標(biāo)志性特征,如增殖信號(hào)的持續(xù)活化、抵抗細(xì)胞死亡、維持細(xì)胞持續(xù)復(fù)制、誘導(dǎo)血管生成、促進(jìn)增殖及轉(zhuǎn)移、改變能量代謝等。同時(shí),TAFs增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗能力。因此,靶向TAFs阻斷其對(duì)腫瘤的“支持”作用是腫瘤治療的新策略。 基于以上研究背景,本研究主要探索TAFs對(duì)HCC發(fā)生、發(fā)展的作用。我們將從三個(gè)方面展開研究。首先,在人HCC組織中分離并純化TAFs及癌旁成纖維細(xì)胞(peri-tumor fibroblasts,PTFs),利用細(xì)胞免疫化學(xué)及Real-time PCR檢測(cè)TAFs與PTFs相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá),研究二者生物學(xué)特性差異；在此基礎(chǔ)上建立TAFs與肝腫瘤細(xì)胞株體外共培養(yǎng)系統(tǒng),觀察TAF對(duì)肝腫瘤細(xì)胞株增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、成球、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation,EMT)、皮下成瘤與轉(zhuǎn)移等生物學(xué)效應(yīng)的影響；進(jìn)一步研究TAFs促進(jìn)腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制,芯片檢測(cè)并篩選TAFs與PTFs分泌差異的趨化因子,探討趨化因子對(duì)TAFs與肝腫瘤細(xì)胞Cross-talk的作用并尋找相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。為HCC的臨床治療提供新的思路和方法。 [實(shí)驗(yàn)方法] 一、肝癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的分離與鑒定 1.分離并純化TAFs與PTFs 將人HCC組織與癌旁組織剪碎,膠原酶Ⅳ消化完全后梯度離心得到TAFs與PTFs,利用Anti-fibroblast磁珠純化原代分離的成纖維細(xì)胞。 2.鑒定TAFs與PTFs 細(xì)胞免疫化學(xué)與Real-Time PCR檢測(cè)TAFs與PTFs細(xì)胞α-SMA、Vimentin、FSP-1及EMT相關(guān)指標(biāo)表達(dá)。 3. TAFs與PTFs生物學(xué)特性的差異 將不同TAFs與PTFs以3×103/孔的數(shù)量接種于96孔板中,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,CCK-8每天檢測(cè)TAFs與PTFs的增殖情況；將TAFs與PTFs消化并重懸于無血清DMEM中,以4×104/孔的數(shù)量接種于上層遷移小室,24小時(shí)后檢測(cè)TAFs與PTFs的遷移情況。 二、TAFs與PTFs對(duì)肝腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 1.建立TAFs、PTFs與肝腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng) 將’TAFs與PTFs置于0.4μm共培養(yǎng)小室中與下層腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)或收集 TAFs與PTFs培養(yǎng)液上清(條件培養(yǎng)基Conditional medium,CM)直接培養(yǎng)肝腫瘤細(xì)胞。 2. TAFs對(duì)肝腫瘤細(xì)胞株增殖、侵襲及遷移能力的影響 建立TAFs與PTFs與肝腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng),CCK-8檢測(cè)TAFs與PTFs或其條件培養(yǎng)基(含3%FBS的DMEM培養(yǎng)成纖維細(xì)胞24小時(shí))對(duì)不同肝腫瘤細(xì)胞株增殖能力的影響；將TAFs與PTFs (1×104)接種于24孔板底層,肝腫瘤細(xì)胞株LM3置于上層侵襲小室中,24小時(shí)后利用結(jié)晶紫對(duì)侵襲細(xì)胞進(jìn)行染色,顯微鏡觀察并拍照；將TAFs與PTFs細(xì)胞或條件培養(yǎng)基(含3%FBS的DMEM培養(yǎng)成纖維細(xì)胞24小時(shí))置于24孔板底層,肝腫瘤細(xì)胞株接種于上層遷移小室中,24小時(shí)后利用結(jié)晶紫對(duì)遷移細(xì)胞進(jìn)行染色,顯微鏡觀察并拍照。 3. TAFs對(duì)肝腫瘤細(xì)胞株上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用 將2×105的Huh7細(xì)胞接種于35mm培養(yǎng)皿中,待其貼壁后更換培液為TAFs與PTFs條件培養(yǎng)基(含3%FBS的DMEM培養(yǎng)成纖維細(xì)胞24小時(shí)),Real-time PCR及細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)EMT相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)。 4. TAFs對(duì)肝腫瘤細(xì)胞株“干性”的影響 TAFs與PTFs條件培養(yǎng)基處理(干細(xì)胞專用培養(yǎng)液培養(yǎng)成纖維細(xì)胞24小時(shí))Huh7細(xì)胞48小時(shí),Real-time PCR檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cell,CSC)以及自我更新相關(guān)基因在mRNA表達(dá)水平的變化；流式細(xì)胞儀分選Huh7細(xì)胞中Epcam陽性及陰性的細(xì)胞,將分選后的細(xì)胞以每孔10個(gè)細(xì)胞的數(shù)量加入低吸附的96孔板中(未分選的Huh7細(xì)胞作為對(duì)照),利用TAFs與PTFs條件培養(yǎng)基(干細(xì)胞專用培養(yǎng)液培養(yǎng)成纖維細(xì)胞24小時(shí))處理細(xì)胞,7天和14天分別計(jì)數(shù)成球細(xì)胞,計(jì)算成球率。 5.TAFs對(duì)肝腫瘤細(xì)胞株成瘤及轉(zhuǎn)移能力的影響 皮下成瘤實(shí)驗(yàn)：將TAFs與PTFs與人肝癌細(xì)胞株LM3按1：5制成混合細(xì)胞懸液(LM3:1×106,TAFs/PTFs:2×105),接種于裸鼠皮下,建立小鼠皮下成瘤模型,觀察其皮下成瘤情況。 體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)：將luciferase標(biāo)記的Huh7細(xì)胞與TAFs/PTFs以5：1的比例制成細(xì)胞混合懸液(Huh7:1×106,TAFs/PTFs:2×105),接種于NOD-SCID小鼠皮下,建立小鼠皮下轉(zhuǎn)移模型,活體成像儀觀察轉(zhuǎn)移情況。 三、TAF促進(jìn)HCC惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制 1.芯片檢測(cè)TAFs與PTFs趨化因子表達(dá)的差異 收集三對(duì)TAFs與PTFs培養(yǎng)液上清(DMEM無血清培養(yǎng)24小時(shí)),采用Raybiotech試劑盒進(jìn)行趨化因子表達(dá)譜的檢測(cè)。篩選出表達(dá)差異明顯的趨化因子；收集不同來源TAFs與PTFs的RNA(DMEM無血清培養(yǎng)24小時(shí))驗(yàn)證芯片結(jié)果。 2. Real-time PCR檢測(cè)芯片結(jié)果中有變化的趨化因子及其受體的表達(dá)。檢測(cè)三種趨化因子(CCL2、CCL5、CXCL16)對(duì)肝腫瘤細(xì)胞株Huh7遷移能力的影響。 將趨化因子CCL2、CCL5、CXCL16以0.10、20、40ng/ml的濃度分別加入24孔板下層培養(yǎng)液(500μl含1%FBS的DMEM)中,在上層遷移小室中接種Huh7細(xì)胞(5×104),培養(yǎng)24小時(shí)后染色并拍照；收集PTFs與TAFs的條件培養(yǎng)基(含1%FBS的DMEM培養(yǎng)成纖維細(xì)胞24小時(shí)),將趨化因子CCL2、CCL5、CXCL16中和抗體以0.1、5μg/ml的濃度分別加入PTFs與TAFs的條件培養(yǎng)基中,混勻后以500μl／孔的體積加入24孔板。在上層遷移小室中接種Huh7細(xì)胞(5×104),培養(yǎng)24小時(shí)后染色并拍照。 3.TAFs對(duì)肝腫瘤細(xì)胞株信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響 Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染報(bào)告基因質(zhì)粒(Wnt、Hippo、NF-κB、Hedgehog、TGF-β),轉(zhuǎn)染后6小時(shí)將培養(yǎng)液更換為PTFs與TAFs的條件培養(yǎng)基(含1%FBS的DMEM培養(yǎng)成纖維細(xì)胞24小時(shí)),共培養(yǎng)24小時(shí)后檢測(cè)熒光素酶表達(dá)情況。篩選出有變化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；將Huh7細(xì)胞(1×105)接種于35mm培養(yǎng)皿,貼壁后將培養(yǎng)液更換為PTFs與TAFs的條件培養(yǎng)基(含1%FBS的DMEM培養(yǎng)成纖維細(xì)胞24小時(shí)),24小時(shí)后收集RNA,Real-time PCR檢測(cè)Hedgehog和TGF-β通路相關(guān)基因的表達(dá)。 4.趨化因子對(duì)Hedgehog和TGF-β信號(hào)通路的影響 Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染Hedgehog和TGF-β報(bào)告基因質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染后6小時(shí)將培養(yǎng)液更換為無血清DMEM培養(yǎng)基,趨化因子CCL2、CCL5、CXCL16以0、5、10、20ng/ml濃度加入培養(yǎng)基中,檢測(cè)Hedgehog和TGF-β通路的活化情況；利用PTFs與TAFs條件培養(yǎng)基(含1%FBS的DMEM培養(yǎng)成纖維細(xì)胞24小時(shí))處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞,加入CCL2、CCL5、CXCL16中和抗體(0、1、5μg/ml),共培養(yǎng)24小時(shí)后,檢測(cè)Hedgehog和TGF-β通路的活化情況；將Huh7細(xì)胞(1×105)接種于35mm培養(yǎng)皿,貼壁后利用無血清DMEM饑餓細(xì)胞12小時(shí),趨化因子CCL2、CCL5、CXCL16以0、10、20ng/ml濃度加入培養(yǎng)基中,24小時(shí)后收集RNA,Real-time PCR檢測(cè)Hedgehog和TGF-β通路相關(guān)基因的表達(dá)。 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析,結(jié)果以X±SD表示。多組間采用One-Way ANOVA分析,P0.05為統(tǒng)計(jì)結(jié)果具有顯著性差異。[實(shí)驗(yàn)結(jié)果] 一、原代分離TAFs與PTFs的表型與生物學(xué)特性不同 1.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示PTFs與TAFs均表達(dá)α-SMA、Vimentin與FSP-1,其中α-SMA與FSP-1在TAFs中表達(dá)明顯強(qiáng)于PTFs。但是Vimentin在二者之間表達(dá)未見差別。 2. Real-Time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示α-SMA、FAP、PDGF在TAFs中表達(dá)高于PTFs二、N-cadherin、Snail、Twist(P0.05)；EMT間質(zhì)相關(guān)指標(biāo)TAFs在PTFs中表達(dá)高于E-cadherin(P0.05),而上皮相關(guān)指標(biāo)PTFs在 3. TAFs中表達(dá)較高(P0.05)。PTFs。 的增殖能力與遷移能力高于TAFs促進(jìn)肝腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化 1.TAFs促進(jìn)肝腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲與遷移 (1)成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理LM3與Huh7細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TAFs促進(jìn)腫瘤細(xì)胞株增殖作用明顯高于PTFs與正常對(duì)照組；另外,不同TAFs的條件培養(yǎng)基與Huh7細(xì)胞共培養(yǎng),Huh7細(xì)胞增殖出現(xiàn)不同程度的增加；TAF細(xì)胞與MHCC-H、SK-Hep1、 Huh7、PLC共培養(yǎng),可顯著促進(jìn)不同腫瘤細(xì)胞株增殖。 (2)侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TAF細(xì)胞處理組LM3細(xì)胞的侵襲率為89.7%,高于PTFs處理組(66.3%)與對(duì)照組(39.1%)(P0.05)。 (3)遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同來源TAFs條件培養(yǎng)基均可促進(jìn)Huh7細(xì)胞遷移,其促遷移能力高于PTF組與對(duì)照組(P0.05)；另外,TAFs增強(qiáng)肝腫瘤細(xì)胞MHCC-H、 SK-Hep1、Huh7、PLC細(xì)胞的遷移能力。 2. TAFs促進(jìn)肝腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 TAFs條件培養(yǎng)基處理Huh7細(xì)胞,Real-time PCR結(jié)果顯示Huh7細(xì)胞間質(zhì)代表基因N-cadherin、Snail、Twist與a-SMA表達(dá)均上調(diào)(與PTFs組相比,P0.01),而上皮代表基因E-cadherin表達(dá)下調(diào)(P0.01)。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示E-cadherin與Vimentin熒光強(qiáng)度在對(duì)照組、PTFs與TAFs組間未見明顯差別,但是Vimentin陽性細(xì)胞比例在TAFs條件培養(yǎng)基處理組顯著增多。 3. TAFs增加肝腫瘤細(xì)胞的“干性” TAF條件培養(yǎng)基處理Huh7細(xì)胞,Real-time PCR結(jié)果顯示CSC相關(guān)基因CD44、 CD90、CD133與Epcam表達(dá)均上調(diào)(P0.05)；此外,自我更新相關(guān)基因Sox2、 Oct4、Nanog、Klf4表達(dá)亦明顯上調(diào)(P0.05)；利用流式細(xì)胞儀將Huh7細(xì)胞分為Epcam陽性與Epcam陰性兩組,未分選的Huh7細(xì)胞作為對(duì)照,進(jìn)行成球?qū)嶒?yàn)。結(jié)果顯示TAFs條件培養(yǎng)基可以增加Epcam陽性、Epcam陰性以及未分選Huh7細(xì)胞的成球率,其中Epcam陽性細(xì)胞成球率增加最為明顯,約為12%(P0.05)。而PTFs對(duì)細(xì)胞成球能力無明顯影響。 4. TAFs增加肝腫瘤細(xì)胞的成瘤與轉(zhuǎn)移能力 成瘤實(shí)驗(yàn)：TAFs組裸鼠約在第6天開始出現(xiàn)腫瘤,PTFs組出現(xiàn)腫瘤的時(shí)間在第9天；21天后處死小鼠,結(jié)果顯示TAFs組腫瘤瘤重與體積均大于PTFs組,說明TAFs促進(jìn)肝腫瘤細(xì)胞成瘤的能力強(qiáng)于PTFs。 轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)：第七周將小鼠麻醉,腹腔注射熒光素鉀,取出小鼠左側(cè)上肢骨、肺、脾、肝、腎、腦進(jìn)行熒光掃描,結(jié)果顯示PTFs組5只小鼠有一只出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,而TAFs組7只小鼠有6只出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,說明TAFs可顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移。 三、 TAFs促進(jìn)HCC惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制 1.TAFs與PTFs趨化因子表達(dá)不同 芯片檢測(cè)顯示,TAFs培養(yǎng)上清中7種趨化因子含量明顯于高PTFs。Real-time PCR證實(shí)CCL2(MCP-1)、CCL5(RANTES)、CXCL16在TAFs中表達(dá)顯著高于PTFs組,其余4種(CCL7、CCL11、CXCL1、CXCL8)在二者之間未見明顯變化,但是相關(guān)趨化因子受體在TAFs中表達(dá)均高于PTFs。另外,TAFs與Huh7細(xì)胞共培養(yǎng)后,Huh7細(xì)胞中CCL2、CCL5、CXCL16相應(yīng)受體CCR2、CCR5與CXCR6的表達(dá)顯著升高(P0.05)。 2.趨化因子CCL2、CCL5、CXCL16促進(jìn)Huh7細(xì)胞遷移 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CXCL16促遷移作用最強(qiáng),CCL2、CCL5促進(jìn)遷移的能力相似,在20ng/ml濃度刺激下,遷移率約為30%(P0.001)。同時(shí),趨化因子CCL2、 CCL5、CXCL16中和抗體可部分阻斷TAFs促進(jìn)Huh7遷移的作用。 3. TAFs激活肝腫瘤細(xì)胞Hedgehog和TGF-β通路 五個(gè)被檢測(cè)通路TGF-β、NF-κB、Wnt、Hippo)中只有Hedgehog與TGF-β在TAFs刺激后活化,其中TAFs處理組TGF-β通路明顯活化,其熒光素酶表達(dá)為對(duì)照組的9倍,Hedgegog通路熒光素酶表達(dá)為對(duì)照組的2.5倍(P0.01)；利用Real-time PCR檢測(cè)TAFs是否激活Hedgehog和TGF-β通路下游基因,結(jié)果顯示TAFs上調(diào)TGF-β通路smad-5與c-myc,Hedgehog通路下游基因Gli-1、Shh、Bcl-2亦可被TAFs活化。 4.趨化因子對(duì)Hedgehog和TGF-P信號(hào)通路的影響 報(bào)告基因檢測(cè)趨化因子對(duì)通路的活化作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCL16激活TGF-β通路,CCL2、CCL5活化Hedgehog通路。另外,CCL5、CXCL16中和抗體可分別阻斷TAFs對(duì)Hedgehog與TGF-β通路的活化作用。提示TAFs對(duì)兩個(gè)通路的活化作用部分通過CCL5、CXCL16實(shí)現(xiàn)。Real-time PCR檢測(cè)趨化因子對(duì)通路下游基因的作用,結(jié)果顯示CCL2、CCL5激活Hedgehog通路下游基因Shh、Bcl-2、Gli-1,CXCL16上調(diào)TGF-β通路c-myc與smad-5的表達(dá)。 [結(jié)論] 1.TAFs高表達(dá)a-SMA與FSP-1,其增殖和遷移能力高于PTFs。 2. TAFs促進(jìn)肝腫瘤細(xì)胞株的增殖、侵襲、遷移、體內(nèi)成瘤及轉(zhuǎn)移。 3. TAFs促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,維持肝腫瘤細(xì)胞的“干細(xì)胞特性”。 4. CCL2、CCL5與CXCL16等TAFs分泌的趨化因子通過激活TGF-P與Hedgehog通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

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【參考文獻(xiàn)】

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【相似文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)作用及其機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：161598