本文選題：雄激素受體　切入點(diǎn)：核轉(zhuǎn)出蛋白　出處：《北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)》2017年04期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：目的:探討位于雄激素受體(androgen receptor,AR)配體結(jié)合域中具有出核轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)肽的核轉(zhuǎn)出蛋白(nuclear export signal of androgen receptor,NESAR)對(duì)前列腺癌雄激素受體蛋白表達(dá)和穩(wěn)定性調(diào)節(jié)的機(jī)制。方法:綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)融合蛋白表達(dá)載體p EGFP-AR(1-918aa),p EGFP-NESAR(743-817aa),p EGFP-NAR(1-665aa)和p EGFP-NAR-NESAR,及NESAR的賴氨酸突變體(賴氨酸K突變?yōu)榫彼酭)p EGFPNESAR K776R,p EGFP-NESAR K807R和p EGFP-NESAR K776R/K807R,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞PC3后,采用熒光顯微鏡、蛋白質(zhì)免疫印跡和免疫沉淀,檢測(cè)NESAR對(duì)雄激素受體穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)。結(jié)果:在熒光顯微鏡下,含NESAR的融合蛋白呈胞漿定位,熒光信號(hào)強(qiáng)度比不含NESAR的融合蛋白明顯減弱,且含NESAR的融合蛋白表達(dá)水平顯著低于不含NESAR的融合蛋白表達(dá)水平。在蛋白合成抑制劑放線菌酮處理下,GFP-NESAR和GFP-NAR-NESAR的半衰期小于6 h,而對(duì)照GFP和GFP-NAR的表達(dá)相對(duì)更穩(wěn)定,半衰期大于24 h。融合蛋白GFP-NESAR在蛋白酶體抑制劑MG132的處理下,其蛋白表達(dá)顯著增加,并呈現(xiàn)劑量依賴性,而MG132對(duì)GFP蛋白穩(wěn)定性沒有顯著影響;在蛋白合成被抑制的情況下,MG132同樣顯著抑制了GFP-NESAR融合蛋白的降解,且蛋白表達(dá)呈劑量依賴性的增加。GFP免疫沉淀的結(jié)果顯示,GFP-NESAR融合蛋白的泛素化水平明顯高于GFP對(duì)照。賴氨酸位點(diǎn)K776和K807突變的NESAR的泛素化水平顯著降低,且蛋白穩(wěn)定性提高,賴氨酸位點(diǎn)K776和K807是介導(dǎo)NESAR發(fā)生泛素化的關(guān)鍵氨基酸殘基。結(jié)論:核轉(zhuǎn)出蛋白NESAR具有降解不穩(wěn)定性,作為多聚泛素化修飾的識(shí)別信號(hào),介導(dǎo)了其融合蛋白在前列腺癌細(xì)胞中通過泛素-蛋白酶體途徑的降解。本研究為AR蛋白水平和/或活性的調(diào)控開辟一種新的研究思路,有助于對(duì)AR降解分子機(jī)制的了解和在前列腺癌產(chǎn)生去勢(shì)抗性的過程中對(duì)AR靶向的密切調(diào)控。
[Abstract]:Objective: to investigate the mechanism of expression and stability of androgen receptor receptor receptor protein in prostate cancer by nuclear export signal of androgen receptor NESAR, which is located in the ligand binding domain of androgen receptor receptor. The fusion protein expression vector pEGFP-ARO1-918aAARP / EGFP-NESARN 743-817aar-EGFP-NARPNAR1-665aaa) and the lysine mutants of NESAR (lysine K mutated to arginine EGFPNESAR K776Rtp EGFP-NESAR K807R and p EGFP-NESAR K776RK807R) were transfected into PC3 cells. The regulation of NESAR on the stability of androgen receptor was detected by fluorescence microscope, Western blot and immunoprecipitation. Results: under fluorescence microscope, the fusion protein containing NESAR was cytoplasmic located. The intensity of fluorescence signal was significantly lower than that of fusion protein without NESAR. The expression level of fusion protein containing NESAR was significantly lower than that of fusion protein without NESAR. The half-life of GFP-NESAR and GFP-NAR-NESAR was less than 6 hours after treatment with protein synthesis inhibitor actinomycin, but the expression of GFP and GFP-NAR in control group was more stable. The half-life of the fusion protein GFP-NESAR was more than 24 h. The protein expression of the fusion protein GFP-NESAR was significantly increased in a dose-dependent manner under the treatment of proteasome inhibitor MG132, but MG132 had no significant effect on the stability of GFP protein. When protein synthesis was inhibited, MG132 significantly inhibited the degradation of GFP-NESAR fusion protein. The protein expression was increased in a dose-dependent manner. The results of immunoprecipitation showed that the ubiquitin level of GFP-NESAR fusion protein was significantly higher than that of GFP control. The ubiquitin level of Lysine K776 and K807 mutant NESAR was significantly decreased, and the protein stability was improved. Lysine sites K776 and K807 are the key amino acid residues that mediate the ubiquification of NESAR. Conclusion: the nucleocapsid NESAR has degradation instability and is used as a recognition signal for polyubiquitin modification. It mediates the degradation of its fusion protein by ubiquitin proteasome pathway in prostate cancer cells. This study provides a new approach for the regulation of AR protein level and / or activity. It is helpful to understand the molecular mechanism of AR degradation and to regulate AR targeting in the process of castration resistance of prostate cancer.
【作者單位】： 北京大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科北京大學(xué)泌尿外科研究所國家泌尿男生殖系腫瘤研究中心;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(81402083)資助~~
【分類號(hào)】：R737.25

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本文編號(hào)：1612327