發(fā)布時(shí)間：2018-03-14 07:06

  本文選題：索拉非尼耐藥　切入點(diǎn)：c-FLIP　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:索拉非尼(Sorafenib,Sora)是臨床上治療中晚期肝癌推薦使用的分子靶向治療藥物,但是在治療過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)各種副作用,更重要的是,有相當(dāng)一部分病人會(huì)對(duì)sorafenib產(chǎn)生耐藥。當(dāng)前針對(duì)sorafenib耐藥的機(jī)制研究紛繁復(fù)雜,涉及諸多信號(hào)通路和生物分子,然而目前的研究尚不能全面揭示sorafenib耐藥的機(jī)制。文獻(xiàn)報(bào)道,sorafenib可以激活CD95/Fas誘導(dǎo)外源性凋亡,而caspase-8是外源性凋亡途徑中重要的起始蛋白,caspase-8激活后可以引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)。c-FLIP是caspase-8的重要抑制蛋白,在許多腫瘤中高表達(dá),與凋亡抑制密切相關(guān)。同時(shí)c-FLIP位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum,ER)膜上,具有調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)的作用,而后者與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),參與化療藥物抵抗。由此我們?cè)O(shè)想,c-FLIP/ERS信號(hào)通路是否參與調(diào)節(jié)sorafenib耐藥,是引起sorafenib耐藥的機(jī)制之一?同時(shí),課題組成員在中醫(yī)藥防治肝癌方面具有一定的研究基礎(chǔ)且具有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn),并在長(zhǎng)期的臨床研究中總結(jié)經(jīng)驗(yàn)和用藥,歸納出中藥小復(fù)方“解毒方”(Jiedu Fang,JDF),以此方為基礎(chǔ)開展的多中心臨床研究發(fā)現(xiàn),可以延長(zhǎng)晚期肝癌患者的生存期,尤其是部分sorafenib耐藥或者副作用較大的病人。中醫(yī)藥在逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐藥方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),那么中藥小復(fù)方“解毒方”能否可以改善索拉非尼耐藥,其機(jī)制是否涉及調(diào)節(jié)c-FLIP/ERS?研究目的:1.構(gòu)建sorafenib耐藥人肝癌細(xì)胞株,并觀察sorafenib對(duì)敏感/耐藥肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。2.分別觀察sorafenib對(duì)敏感/耐藥肝癌細(xì)胞株ERS及下游凋亡和自噬通路的作用,并研究c-FLIP對(duì)ERS和相關(guān)凋亡通路的影響,探討其調(diào)節(jié)耐藥的可能機(jī)制。3.體外探討解毒方改善sorafenib耐藥是否通過(guò)調(diào)節(jié)c-FLIP與ERS相關(guān)通路發(fā)揮作用。4.進(jìn)一步在體內(nèi)論證解毒方聯(lián)合sorafenib對(duì)于耐藥肝癌細(xì)胞皮下移植瘤的抑制作用。研究方法:1.采用HepG2、Huh7肝癌細(xì)胞,通過(guò)MTT篩選sorafenib藥物濃度,選擇略低于IC50的藥物濃度開始長(zhǎng)期持續(xù)的sorafenib藥物干預(yù),誘導(dǎo)為HepG2-R、Huh7-R耐藥肝癌細(xì)胞株,通過(guò)MTT、流式分別檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡,驗(yàn)證耐藥細(xì)胞株HepG2-R、Huh7-R是否構(gòu)建成功。2.觀察ERS相關(guān)通路在sorafenib耐藥中的作用,并采用ERS抑制劑4-苯基丁酸(4-Phenylbutyric acid,4-PBA)反相驗(yàn)證,進(jìn)一步比較敏感株和耐藥株中ERS引起的凋亡及自噬情況,WB檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá),電鏡下觀察自噬體的形成,研究ERS在sorafenib耐藥中的作用。3.根據(jù)ERS對(duì)相關(guān)凋亡通路的影響,觀察凋亡抑制蛋白c-FLIP在sorafenib耐藥中的作用,并采用si RNA干擾技術(shù)及過(guò)表達(dá)技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。4.體外觀察解毒方對(duì)sorafenib耐藥的改善作用,并通過(guò)Western blot檢測(cè)聯(lián)合用藥對(duì)c-FLIP和ERS蛋白的影響,探討其可能機(jī)制。5.通過(guò)構(gòu)建soranfenib耐藥人肝癌細(xì)胞株皮下移植瘤裸鼠模型,在體內(nèi)觀察解毒方改善sorafenib耐藥作用及可能機(jī)制。結(jié)果:1.成功構(gòu)建sorafenib耐藥人肝癌細(xì)胞株HepG2-R、Huh7-R,sorafenib培養(yǎng)濃度分別為6.0μM、9.0μM。Sorafenib處理后,計(jì)算HepG2-R、HepG2的IC50,48h時(shí)分別為18.17μM、9.26μM,72h時(shí)分別為12.74μM、6.48μM,Huh7-R、Huh7的IC50,48h時(shí)分別為23.36μM、10.13μM,72h時(shí)分別為16.88μM、5.84μM,各組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);流式分別檢測(cè)耐藥株和敏感株的結(jié)果與MTT結(jié)果相一致,48小時(shí)耐藥株凋亡率明顯低于敏感株(P0.05);進(jìn)一步檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn),在相同濃度的sorafenib作用下,敏感細(xì)胞中的PARP、caspase-8、caspase-3激活比耐藥株更明顯。2.研究ERS在sorafenib耐藥過(guò)程中的作用,通過(guò)比較敏感/耐藥細(xì)胞ERS相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn),耐藥細(xì)胞IRE1和PERK信號(hào)通路激活程度更高,部分ERS蛋白表達(dá)水平更高,使用ERS抑制劑4-PBA可以使耐藥株對(duì)sorafenib的敏感性增加,降低PERK、Bip的表達(dá)水平,上調(diào)Chop水平,凋亡蛋白caspase-8、caspase-9、caspase-3、PARP活化。但是對(duì)ERS凋亡相關(guān)caspase-12的影響不明顯。進(jìn)一步研究ERS相關(guān)自噬發(fā)現(xiàn),與敏感株比較,耐藥細(xì)胞自噬水平較高,P62表達(dá)減少,LC3II表達(dá)明顯增加,ERS抑制劑4-PBA聯(lián)合sorafenib能夠使P62增加,使LC3I向II轉(zhuǎn)化減少,電鏡觀察到了相似的結(jié)果,耐藥株與sorafenib處理組可以看到較多的自噬體,而4-PBA處理后,自噬體數(shù)量則明顯減少;分別給予自噬抑制劑3-Methyladenine(3-MA)和Chloroquine(CQ)處理耐藥株后,sorafenib對(duì)耐藥株的增殖抑制率和凋亡率明顯增加。3.通過(guò)比較敏感株和耐藥株中凋亡蛋白caspase-8、caspase-9、caspase-12,我們發(fā)現(xiàn),caspase-8在經(jīng)過(guò)sorafenib處理的敏感細(xì)胞中被顯著激活,而在耐藥株中則不易被激活,因此我們進(jìn)一步觀察caspase-8抑制蛋白c-FLIP在sorafenib耐藥中的作用。Sorafenib處理后,耐藥細(xì)胞中c-FLIP的表達(dá)要高于敏感細(xì)胞;采用si RNA干擾c-FLIP后,無(wú)論是耐藥的Huh7-R細(xì)胞還是HepG2-R細(xì)胞對(duì)sorafenib的敏感性都顯著增加,c-FLIP si RNA組與NC組比較,細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率增加(P0.05);進(jìn)一步觀察c-FLIP si RNA干擾對(duì)ERS相關(guān)蛋白和caspase-8的影響,經(jīng)過(guò)sorafenib處理,HepG2-R的PERK、Bip水平降低,Chop水平升高,caspase-8剪切體明顯增多,表明c-FLIP在調(diào)節(jié)耐藥細(xì)胞的ERS相關(guān)通路和抑制caspase-8激活方面發(fā)揮了重要作用。過(guò)表達(dá)c-FLIP后,可以降低解毒方聯(lián)合sorafenib對(duì)于耐藥細(xì)胞的抑制作用,進(jìn)一步證實(shí),解毒方通過(guò)降低c-FLIP改善sorafenib耐藥。4.解毒方在體外可以改善sorafenib耐藥。將不同濃度的解毒方(JDF0.1mg/ml、JDF0.2mg/ml、JDF0.4mg/ml)、sorafenib(Sora2.5μM、Sora5μM、Sora7.5μM)以及解毒方(JDF0.2mg/ml、JDF0.4mg/ml、JDF0.5mg/ml)、sorafenib(Sora5μM、Sora10μM、Sora15μM)分別作用于耐藥HepG2-R和Huh7-R細(xì)胞48h,未發(fā)現(xiàn)明顯的增殖抑制作用,存活率均大于80%(P0.05)。而將不同濃度的JDF與sorafenib聯(lián)合應(yīng)用,則可以顯著增加sorafenib耐藥株的抑制率,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),且成一定的濃度依賴性,通過(guò)計(jì)算聯(lián)合作用指數(shù)(combined index,CI),CIHepG2-R=0.58(JDF0.4mg/ml+Sora5μM),CIHuh7-R=0.33(JDF0.5mg/ml+Sora5μM),表明JDF和sorafenib具有一定協(xié)同作用。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),JDF和sorafenib聯(lián)合作用后,c-FLIP表達(dá)降低,且呈濃度依賴性,PERK通路激活,Chop水平上調(diào)。5.體內(nèi)結(jié)果提示,JDF聯(lián)合sorafenib可以顯著抑制耐藥細(xì)胞皮下瘤生長(zhǎng)。構(gòu)建Huh7、Huh7-R皮下移植瘤裸鼠模型,兩組裸鼠給予低劑量sorafenib干預(yù)約4周后,僅Huh7-R組裸鼠出現(xiàn)皮下移植瘤,Huh7組未見明顯皮下瘤,表明體內(nèi)耐藥模型構(gòu)建成功,分別給予Vehicle、Sorafenib、JDF+Sorafenib、JDF干預(yù)15天后,Sorafenib與JDF組的瘤重與Vehicle組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而JDF+Sorafenib組瘤重低于Vehicle組瘤重,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),通過(guò)Western Blot檢測(cè)腫瘤組織中的蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),JDF聯(lián)合sorafenib能夠激活I(lǐng)RE1和PERK通路,上調(diào)促凋亡chop蛋白水平,同時(shí)抑制c-FLIP表達(dá),激活caspase-8,與體外結(jié)果一致。此外,各組裸鼠肝腎組織病理結(jié)果提示,本實(shí)驗(yàn)中JDF與sorafenib聯(lián)合應(yīng)用無(wú)體內(nèi)毒性。結(jié)論:1.索拉非尼耐藥與c-FLIP高表達(dá)引起的caspase-8激活抑制、ERS激活繼而自噬增強(qiáng),而凋亡受抑制有關(guān)。2.解毒方改善索拉非尼耐藥,其機(jī)制與調(diào)節(jié)c-FLIP/ERS有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：1610127