本文選題：腫瘤　切入點(diǎn)：葡萄糖缺乏　出處：《上海交通大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：腫瘤組織以快速增長(zhǎng)為其基本特征,因此與正常組織相比,腫瘤組織需要大量的新生血管為它提供營(yíng)養(yǎng)。但是腫瘤的新生血管往往結(jié)構(gòu)紊亂且功能不全,新生血管的生長(zhǎng)速度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上腫瘤生長(zhǎng)的需要。因此,腫瘤組織離血管較遠(yuǎn)的部分存在于低葡萄糖的環(huán)境中,據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,結(jié)腸癌和胃癌組織中心的葡萄糖濃度分別僅有0.12和0.4mM。但是處在缺乏葡萄糖環(huán)境中的腫瘤組織依然能夠生存。在體內(nèi),腫瘤能夠調(diào)節(jié)自己適應(yīng)葡萄糖缺乏的環(huán)境,但是在體外培養(yǎng)的環(huán)境中腫瘤細(xì)胞缺乏葡萄糖供給時(shí)則無(wú)法生存。腫瘤在體內(nèi)是如何適應(yīng)葡萄糖缺乏的環(huán)境,以等待血管新生獲得能量,這一問(wèn)題的深入研究對(duì)于揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)理顯得尤為重要。Otto Warburg首先觀察到即使在氧氣充足的環(huán)境中,腫瘤仍然傾向于利用糖酵解途徑作為分解葡萄糖的主要方式。腫瘤這種特殊的代謝方式的轉(zhuǎn)換,就導(dǎo)致了糖酵解的產(chǎn)物乳酸的積聚。已有一些研究報(bào)道：在人宮頸癌、頭頸部腫瘤、直腸癌、非小細(xì)胞肺癌中乳酸水平升高與較高的轉(zhuǎn)移率和較差的臨床預(yù)后相關(guān)。一些研究指出乳酸可以被腫瘤細(xì)胞利用,通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP,從而為腫瘤細(xì)胞供能。乳酸也可以作為信號(hào)分子發(fā)揮作用,例如促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF,它可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和刺激血管生成。乳酸還可以抑制活化的T細(xì)胞,幫助腫瘤細(xì)胞完成免疫逃逸。在實(shí)體腫瘤中,同時(shí)存在這樣的情況：一方面,血管的發(fā)育生長(zhǎng)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上腫瘤的快速生長(zhǎng),導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)存在葡萄糖缺乏區(qū)域；另一方面,在周邊血管豐富的區(qū)域,葡萄糖供給充足,腫瘤細(xì)胞通過(guò)有氧糖酵解產(chǎn)生了大量的乳酸。這些乳酸分泌到細(xì)胞之間,對(duì)于缺少葡萄糖供給的腫瘤組織有重要病理生理作用。本研究將從體外培養(yǎng)中從細(xì)胞水平驗(yàn)證乳酸對(duì)于腫瘤細(xì)胞應(yīng)對(duì)葡萄糖缺乏的作用,并探討乳酸是如何調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞適應(yīng)葡萄糖缺乏,進(jìn)一步從分子水平揭示乳酸調(diào)節(jié)的可能信號(hào)通路,并從動(dòng)物模型中驗(yàn)證我們的結(jié)果。本研究有助于揭示乳酸參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程,為預(yù)測(cè)和治療腫瘤提供了新靶標(biāo)。第一部分乳酸維持腫瘤細(xì)胞在葡萄糖缺乏中生存為了探究乳酸在腫瘤細(xì)胞抵抗葡萄糖饑餓中的作用,我們首先在無(wú)糖完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞,并添加不同濃度的乳酸。發(fā)現(xiàn)添加乳酸能夠顯著延長(zhǎng)A549細(xì)胞在無(wú)糖培養(yǎng)基的存活時(shí)間。其中在乳酸濃度為20mM的無(wú)糖培養(yǎng)環(huán)境中A549細(xì)胞的生存時(shí)間最長(zhǎng)。對(duì)于其他四種腫瘤細(xì)胞系也具有同樣的效果,表明乳酸能夠幫助腫瘤細(xì)胞在葡萄糖缺乏的環(huán)境中生存。進(jìn)一步我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性乳酸也具有同樣的作用,并且乳酸的作用需要?dú)潆x子與乳酸根離子共同參與。接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中為了證實(shí)在無(wú)糖環(huán)境中乳酸是否是作為能量底物為腫瘤細(xì)胞提供能量,我們發(fā)現(xiàn)同樣濃度的丙酮酸并不能如乳酸一樣延長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞在無(wú)糖環(huán)境中的生存時(shí)間,而且采用Seahorse Bioscience XF24生物能量檢測(cè)儀檢測(cè)添加乳酸前后腫瘤細(xì)胞的氧氣消耗并沒(méi)有明顯的變化,在培養(yǎng)基中添加的乳酸在長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)過(guò)程中也沒(méi)有出現(xiàn)明顯的消耗,采用干擾RNA技術(shù)下調(diào)乳酸進(jìn)入細(xì)胞的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體MCTl和MCT4也沒(méi)有明顯影響乳酸的作用。在乳酸的調(diào)節(jié)下,無(wú)糖環(huán)境中A549細(xì)胞的糖酵解、有氧糖代謝、磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶基因表達(dá)均出現(xiàn)了降低。與乳酸相比,2-DG(糖酵解抑制劑)和魚(yú)藤酮(有氧呼吸抑制劑)在無(wú)糖環(huán)境中對(duì)腫瘤細(xì)胞生存時(shí)間的延長(zhǎng)作用要小得多。因此,乳酸確實(shí)在無(wú)糖環(huán)境中降低了腫瘤細(xì)胞的糖代謝水平,但是其調(diào)節(jié)程度并不足以解釋乳酸長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞在無(wú)糖環(huán)境中生存的作用。進(jìn)一步,我們通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乳酸的參與下無(wú)糖環(huán)境中A549細(xì)胞的凋亡比例明顯下降,這種明顯的凋亡減少使得腫瘤細(xì)胞在無(wú)糖環(huán)境下長(zhǎng)期生存。第二部分 乳酸通過(guò)Bcl-2途徑抵抗腫瘤細(xì)胞因葡萄糖缺乏引起的凋亡在第一部分的實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)乳酸對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株的作用有差異,對(duì)DU145、A549和H1299細(xì)胞株的增殖速度和生存時(shí)間明顯大于PC3和U87-MG細(xì)胞株,據(jù)此將腫瘤細(xì)胞株分乳酸敏度組和不敏感組。在比較了上述二組細(xì)胞株的遺傳學(xué)背景之后,我們通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與乳酸敏感組的細(xì)胞株相比,乳酸不敏感組的PC3和U87-MG的AKT磷酸化增多。接著我們分別使用了AKT抑制劑哌立福新和激活劑胰島素樣生長(zhǎng)因子1,證實(shí)乳酸可以活化AKT。為進(jìn)一步揭示乳酸活化AKT抗凋亡的具體信號(hào)傳過(guò)通路,我們對(duì)ATK的上下游分子分別作了篩查驗(yàn)證。首先,通過(guò)使用P13K抑制劑證實(shí)乳酸能夠通過(guò)P13K顯著并迅速的引起AKT在蘇氨酸308位點(diǎn)和絲氨酸473位點(diǎn)的磷酸化從而將其活化。然后,通過(guò)Western blot, RNA干擾技術(shù)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù),我們證實(shí)了乳酸可通過(guò)上調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)抵抗腫瘤細(xì)胞在無(wú)糖環(huán)境中的細(xì)胞凋亡,并且證實(shí)Bcl-2上調(diào)與mTOR活化有關(guān)。最后,通過(guò)檢測(cè)線粒體釋放細(xì)胞色素C情況和Caspase 9的活性,證實(shí)乳酸上調(diào)Bcl-2通過(guò)抑制細(xì)胞色素C/凋亡蛋白酶活化因子-1/Caspase 9凋亡途徑從而抵抗腫瘤細(xì)胞的凋亡。至此,我們發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信號(hào)通路在乳酸抵抗腫瘤細(xì)胞因葡萄糖缺乏引起凋亡過(guò)程的確切機(jī)制。第三部分 乳酸在腫瘤適應(yīng)葡萄糖缺乏中作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究為驗(yàn)證我們?cè)隗w外發(fā)現(xiàn)的乳酸促腫瘤生存現(xiàn)象和PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信號(hào)通路參與的抗凋亡機(jī)制,我們?cè)O(shè)計(jì)了乳酸作用荷瘤裸鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。建立裸鼠皮下肺癌移植瘤模型,在瘤周皮下注射乳酸和生理鹽水處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸促進(jìn)裸鼠A549肺癌皮下移植瘤生長(zhǎng),減少荷瘤鼠的生存期,減少裸鼠A549肺癌皮下移植瘤壞死。TUNEL和Caspase 3/7檢測(cè)證實(shí)乳酸減少裸鼠A549肺癌皮下移植瘤凋亡。移植瘤的病理切片進(jìn)行免疫組化染色分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸組與生理鹽水組相比,Phospho-AKT (Thr308), Phospho-AKT (Ser 473), Bcl-2和Phospho-mTOR (Ser 2448)的表達(dá)均增多,證實(shí)乳酸促進(jìn)裸鼠A549肺癌皮下移植瘤內(nèi)PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信號(hào)通路活化。結(jié)論1.乳酸能夠維持腫瘤細(xì)胞在無(wú)糖環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間生存,其功能與內(nèi)源性乳酸相似,是由氫離子與乳酸根離子共同的效果。乳酸并不直接為腫瘤細(xì)胞提供能量,但降低了腫瘤細(xì)胞的糖代謝水平。在無(wú)糖環(huán)境中乳酸主要通過(guò)減少腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)維持其生存。2.乳酸通過(guò)PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信號(hào)通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞減少因葡萄糖缺乏引起的細(xì)胞凋亡,乳酸通過(guò)上調(diào)Bcl-2抑制細(xì)胞色素C/凋亡蛋白酶活化因子-l/Caspase-9凋亡途徑。3.乳酸促進(jìn)裸鼠A549肺癌皮下移植瘤生長(zhǎng),減少荷瘤鼠的生存期,減少裸鼠A549肺癌皮下移植瘤壞死和凋亡。乳酸促進(jìn)裸鼠A549肺癌皮下移植瘤內(nèi)PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信號(hào)通路活化。創(chuàng)新點(diǎn)1.發(fā)現(xiàn)并證實(shí)乳酸參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程,為預(yù)測(cè)和治療腫瘤提供了新靶標(biāo)。2.發(fā)現(xiàn)并證實(shí)在無(wú)糖環(huán)境中乳酸并不直接為腫瘤細(xì)胞提供能量,乳酸通過(guò)降低腫瘤細(xì)胞的糖代謝水平,減少腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)維持其生存。3.初步揭示了乳酸促腫瘤生存作用的分子機(jī)制。乳酸通過(guò)PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信號(hào)通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞減少因葡萄糖缺乏引起的細(xì)胞凋亡,通過(guò)上調(diào)Bcl-2抑制細(xì)胞色素C/凋亡蛋白酶活化因子-1/Caspase-9凋亡途徑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.2

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本文編號(hào)：1609802