本文選題：消化系統(tǒng)惡性腫瘤　切入點(diǎn)：lncRNA　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景在全球范圍內(nèi),惡性腫瘤是威脅人類生命健康的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。消化系統(tǒng)主要包括消化道和消化腺,所含器官眾多,惡性腫瘤發(fā)病率也較高。其中肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在世界范圍內(nèi)有著很高的發(fā)病率和死亡率,尤其是在中國(guó),因?yàn)橐腋尾《镜膹V泛流行,肝癌也是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤,死亡率位居第二,HCC患者的數(shù)量大約占了全球患者數(shù)量的一半。另外結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)也是十分常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一,在我國(guó),其死亡率居惡性腫瘤第五位,發(fā)病率和死亡率也呈逐年上升趨勢(shì)。目前,消化系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制尚未完全研究清楚,由于其不良預(yù)后和高死亡率,早期診斷、早期治療就變得尤為重要。臨床上消化系統(tǒng)惡性腫瘤早期診斷主要依賴于病理活檢、影像學(xué)檢查和血清學(xué)標(biāo)志物等,但因具有侵入性或因敏感性、特異性不足,而無(wú)法滿足臨床的需求。尋找敏感性、特異性高的標(biāo)志物用于消化系統(tǒng)惡性腫瘤早期診斷仍是臨床亟待解決的問(wèn)題。非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)通常是指不能翻譯為蛋白的功能性RNA分子,包含短鏈ncRNA(如microRNA,piRNA,siRNA等),長(zhǎng)鏈ncRNA(lncRNA)及環(huán)狀RNA。lncRNA一般是指大于200nt的ncRNA,可在各種層面上調(diào)控基因表達(dá),在細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老、死亡等過(guò)程中均扮演關(guān)鍵角色。近些年研究發(fā)現(xiàn),血液中存在大量且穩(wěn)定的lncRNA,其表達(dá)譜同miRNA一樣,也具有明顯的組織和疾病特異性,即在不同組織、不同腫瘤中具有特異的表達(dá)譜,具有成為腫瘤早診的血液學(xué)標(biāo)志物的潛在價(jià)值。單一 lncRNA作為標(biāo)志物的特異性和敏感性尚且較難滿足臨床需求,將差異表達(dá)的lncRNA組合建立腫瘤特異性表達(dá)譜,將改進(jìn)單一標(biāo)志物的低靈敏度、低特異性問(wèn)題,成為早期診斷的有效手段。此外,腫瘤轉(zhuǎn)移基因(Metastasis-Associated Protein,MTA)家族是一類重要的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因,MTA3是其重要組成成員之一。到目前為止,有研究已發(fā)現(xiàn)MTA3在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)較正常肺組織升高;而在胃食管交界癌、乳腺癌及晚期子宮內(nèi)膜腺癌中表達(dá)下降。其在肝癌和結(jié)直腸癌中尚未有研究,從既往的研究中可以推測(cè),MTA3可能成為組織中的一種標(biāo)志物。目的第一部分:1.用實(shí)時(shí)熒光定量的方法從82例肝細(xì)胞肝癌患者治療前的血清中和74例健康者的血清中檢測(cè)31種lncRNA的含量,并建立表達(dá)譜,利用lncRNA的表達(dá)量對(duì)肝癌進(jìn)行診斷。2.從71例結(jié)直腸癌患者治療前的血清中和70例健康者的血清中檢測(cè)17種lncRNA的含量,并建立表達(dá)譜利用lncRNA的表達(dá)量對(duì)結(jié)直腸進(jìn)行診斷。3.比較癌癥患者術(shù)前術(shù)后血清lncRNA表達(dá)譜的變化,為監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)與進(jìn)展提供依據(jù)。第二部分:1.采用含90對(duì)肝癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本的組織芯片檢測(cè)MTA3蛋白的表達(dá)情況,以尋找預(yù)后指標(biāo)與潛在治療靶點(diǎn)。2.探究MTA3在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中的生物作用。方法第一部分:1.用實(shí)時(shí)熒光定量的方法檢測(cè)血清中l(wèi)ncRNA的含量。從選定的腫瘤相關(guān)的lncRNA中篩選出在腫瘤患者與健康者血清之間表達(dá)有差異的lncRNA。通過(guò)logistic回歸分析建立lncRNA表達(dá)譜,用于區(qū)分癌癥患者與健康者,通過(guò)受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,簡(jiǎn)稱 ROC 曲線)下面積(area under ROC,簡(jiǎn)稱AUC)檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑\斷效力。此外,將表達(dá)譜模型與傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物結(jié)合,并檢驗(yàn)結(jié)合后的診斷效力。2.比較患者術(shù)前術(shù)后血清中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜水平的變化,以及l(fā)ncRNA表達(dá)譜與臨床參數(shù)之間的關(guān)系。第二部分:1.以購(gòu)自上海芯超生物科技有限公司的肝細(xì)胞肝癌組織芯片為研究對(duì)象,芯片含有90對(duì)肝癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本。利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)組織芯片中MTA3蛋白表達(dá)水平,分析其表達(dá)狀態(tài)與肝細(xì)胞肝癌患者臨床特點(diǎn)以及預(yù)后的關(guān)系。2.從肝癌細(xì)胞系中研究MTA3的功能。通過(guò)干擾肝癌細(xì)胞中的MTA3表達(dá),觀察MTA3對(duì)肝癌細(xì)胞生物行為的影響。主要用到的實(shí)驗(yàn)方法包括:細(xì)胞培養(yǎng)、siRNA干擾、western blot、克隆形成、transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)等。結(jié)果第一部分:1.在肝癌患者血清中,被檢測(cè)的31種lncRNA,有25種表達(dá),其中7種表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。2.用多元logistic逐步回歸的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法發(fā)現(xiàn),PVT1和uc002mbe.2二者結(jié)合診斷肝癌的AUC為0.764(95%CI:0.684-0.833)。十折交叉驗(yàn)證AUC為0.744(95%CI:0.662-0.815)。乙肝病毒感染的肝癌患者AUC為0.742(95%CI:0.652-0.818);乙肝病毒感染陰性的患者,AUC 為 0.795(95%CI:0.692-0.876)。3.PVT1和uc002mbe.2組合與肝細(xì)胞肝癌傳統(tǒng)標(biāo)志物AFP相結(jié)合時(shí),無(wú)論AFP界值取20μg/L,20μg/L,400μg/L還是80μg/L,結(jié)合之后的診斷效力都顯著高于AFP單獨(dú)診斷的診斷效力(p0.01)。4.PVT1和uc002mbe.2組合表達(dá)水平與肝細(xì)胞肝癌腫瘤的大小、巴塞羅那分期以及血清膽紅素水平相關(guān)(P0.05);與年齡、性別、飲酒史、血清AFP水平、乙肝病毒感染狀態(tài)、微血管侵犯情況、大血管侵犯情況、淋巴轉(zhuǎn)移、門(mén)脈高壓及血清白蛋白水平無(wú)明顯相關(guān)(p0.05)。5.肝癌患者術(shù)后較術(shù)前血清中PVT]和uc002mbe.2組合表達(dá)水平明顯下降(p =0.011)。6.在結(jié)直腸癌患者血清中,被檢測(cè)的17種lncRNA,有13種表達(dá),其中5種表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。7.用多元logistic逐步回歸的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法發(fā)現(xiàn),LOC285194,RPl1-462C24.1和Nblal2061三者結(jié)合診斷結(jié)直腸癌的AUC為0.793(95%CI:0.709-0.861,靈敏度為68.33%,特異度為86.89%)。其診斷效力要顯著高于傳統(tǒng)的結(jié)直腸癌標(biāo)志物:CEA(0.633;95%CI:0.541-0.719),CA199(0.567;95%CI:0.474-0.656),CA125(0.517;95%CI:0.424-0.608)和 CA724(0.592;95%CI:0.499-0.680)。8.3 種 lncRNA 組合(LOC285194,RP11-462C24.1 和 Nblal2061)與傳統(tǒng)血清標(biāo)志物相結(jié)合,其結(jié)直腸癌診斷效力會(huì)更高。除了與CA125結(jié)合無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外(p0.05),與CEA、CA199、CA724結(jié)合都與比組合本身效力要高。其結(jié)合后的AUC分別為0.845(與CEA結(jié)合),0.855(與CA199結(jié)合),0.798(與CA125結(jié)合)和0.824(與CA724結(jié)合)。9.結(jié)直腸癌患者術(shù)后3-lncRNA組合表達(dá)量低于術(shù)前(p0.01)。第二部分:1.在肝細(xì)胞肝癌組織標(biāo)本中,大于90%的樣本表現(xiàn)為MTA3的核表達(dá)。癌旁組織僅有33.75%的核表達(dá)。41%的癌組織胞漿中MTA3表達(dá),93.75%的癌旁組織胞漿中MTA3表達(dá)。MTA3在肝細(xì)胞肝癌組織中的細(xì)胞核中表達(dá)較癌旁組織顯著升高(p0.05)。2.癌組織中胞核MTA3的表達(dá)水平與腫瘤的轉(zhuǎn)移程正相關(guān)(p= 0.010)。癌組織中胞核MTA3表達(dá)升高,患者總體生存率(OS)顯著縮短(log-rank檢驗(yàn),p0.05)。Cox回歸多因素分析提示癌組織胞核中MTA3的高表達(dá)是影響預(yù)后的獨(dú)立不良因素,HR為2.3(p= 0.035)。3.在被檢測(cè)的 6 種肝癌細(xì)胞系(QGY7701,QGY7703,BEL7404,HepG2,Huh7及BEL7402)中,MTA3在BEL7402中表達(dá)較高。通過(guò)siRNA干擾后,MTA3表達(dá)下調(diào)。隨后的克隆形成、transwell及劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,MTA3下調(diào)后BEL7402細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移力下降。結(jié)論1.血清中2-lncRNA(PVT1和uc002mbe.2)組合為肝細(xì)胞肝癌的診斷提供了一種新的補(bǔ)充方法;3-lncRNA(LOC285194,RP11-462C24.1 和 Nblal2061)組合為結(jié)直腸癌的診斷提供了新的方法。可以提高傳統(tǒng)標(biāo)志物的診斷效力,以及幫助監(jiān)測(cè)治療與復(fù)發(fā)。2.MTA3在肝細(xì)胞肝癌中的胞核中表達(dá)上調(diào),其表上調(diào)與臨床轉(zhuǎn)移相關(guān),與不良預(yù)后相關(guān)。有作為提示預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物的可能。3.在體外實(shí)驗(yàn)中,MTA3有促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用�？赡艹蔀橐环N治療的靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735

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本文編號(hào)：1602122