本文選題：白細(xì)胞介素-8　切入點(diǎn)：黃芪　出處：《北京中醫(yī)藥大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：1目的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一種具有成纖維細(xì)胞外觀、多向分化潛能的多能干細(xì)胞。MSCs最早在骨髓中發(fā)現(xiàn),隨后研究者們陸續(xù)在臍帶、臍血、胎盤、脂肪、肌肉、皮膚、牙周等組織中分離出MSCs。當(dāng)前,幾乎從所有的成體組織、器官中都能成功分離出MSCs。研究顯示MSCs可以通過(guò)直接接觸或分泌細(xì)胞因子起到調(diào)節(jié)免疫的作用。MSCs同時(shí)是腫瘤基質(zhì)的重要組成部分,能夠影響腫瘤局部免疫功能,并有直接或間接影響腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和凋亡的作用。一些研究表明,MSCs具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的作用；另一些研究報(bào)道則顯示MSCs具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。MSCs不但能夠影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能,同時(shí)也能被腫瘤細(xì)胞所影響,甚至有研究顯示,MSCs能夠發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化為腫瘤干細(xì)胞,獲得腫瘤細(xì)胞的相關(guān)特性。腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的實(shí)體性腫瘤,對(duì)化療、放療不敏感。已經(jīng)有報(bào)道在正常腎組織中成功分離出間充質(zhì)干細(xì)胞,但腎細(xì)胞癌組織中MSCs是否存在、腎細(xì)胞癌組織內(nèi)MSCs生物學(xué)特性是否發(fā)生改變、腎細(xì)胞癌組織內(nèi)MSCs對(duì)癌細(xì)胞的影響等問(wèn)題,國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。此外,中藥黃芪具有抑制腎癌的作用已經(jīng)得到認(rèn)可,但具體機(jī)制尚不明確。黃芪是否通過(guò)影響MSCs進(jìn)而抑制腎癌,也需要進(jìn)一步研究。本次研究在正常腎組織和腎細(xì)胞癌組織內(nèi)分離出MSCs,比較兩種來(lái)源MSCs的生物學(xué)特性,觀察兩種來(lái)源MSCs對(duì)腎癌細(xì)胞的遷移和增殖的影響以及相應(yīng)的分子機(jī)制,并觀察黃芪對(duì)MSCs的影響,從而探討MSCs在腎細(xì)胞癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的作用,為如何治療腎細(xì)胞癌尋找新的靶點(diǎn)。2方法實(shí)驗(yàn)一正常腎組織和腎細(xì)胞癌組織中間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和鑒定(1)分別取7例正常腎組織標(biāo)本和8例腎透明細(xì)胞癌組織標(biāo)本,膠原酶+胰酶消化。培養(yǎng)基選用90%α-MEM+10%胎牛血清(FBS)。應(yīng)用貼壁分離篩選法分離、純化MSCs。貼壁細(xì)胞達(dá)培養(yǎng)瓶80%以上后傳代。(2)觀察各代正常腎來(lái)源問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞(KN-MSCs)和腎癌來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(KC-MSCs)的生物學(xué)特性。包括：①觀察各代MSCs的鏡下形態(tài)；②CCK-8法檢測(cè)兩種MSCs的增殖曲線；③PI染色法檢測(cè)兩種MSCs的細(xì)胞周期；④流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種MSCs的表面標(biāo)志分子(CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、HLADR等)的表達(dá)情況；⑤驗(yàn)證兩種MSCs的成脂肪分化能力和成骨分化能力。實(shí)驗(yàn)二間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腎細(xì)胞癌遷移和增殖的影響(1)應(yīng)用腎透明細(xì)胞癌系(786-0),分三組,分別為空白組、KN-MSCs組和KC-MSCs組,作細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。其中KN-MSCs組和KC-MSCs組培養(yǎng)基內(nèi)分別加入收集后濃縮的兩種MSCs培養(yǎng)基上清液。(2)應(yīng)用腎透明細(xì)胞癌系(786-0),分三組,分別為空白組、KN-MSCs組和KC-MSCs組,CCK-8法檢測(cè)三組腎透明細(xì)胞癌株(786-0)的增殖能力。其中KN-MSCs組和KC-MSCs組培養(yǎng)基內(nèi)分別加入收集后濃縮的兩種MSCs培養(yǎng)基上清液。(3)將裸鼠分為三組,分別為空白組、KN-MSCs組和KC-MSCs組,觀察皮下種植瘤的生長(zhǎng)情況。其中,空白組應(yīng)用腎透明細(xì)胞癌系(786-O), KN-MSCs組應(yīng)用腎透明細(xì)胞癌系(786-O)+KN-MSCs, KC-MSCs組應(yīng)用腎透明細(xì)胞癌系(786-O)+KC-MSCs。(4)提取兩種MSCs的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, Realtime-QPCR法檢測(cè)兩種MSCs的部分細(xì)胞因子(IL-8、CCL5、TNF-α、SDF-1、VEGF、PDGF、FGF。EGF。ICAM-1和N-Cadherin等)的表達(dá)情況。(5)應(yīng)用KN-MSCs,分為兩組,分別為空白組和實(shí)驗(yàn)組。提取兩種MSCs的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, Realtime-QPCR法檢測(cè)兩種MSCs的IL-8和血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor, PDGF)的表達(dá)情況。其中,實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基內(nèi)加入收集后濃縮的腎透明細(xì)胞癌系(786-0)培養(yǎng)基上清液。實(shí)驗(yàn)三黃芪對(duì)正常腎組織和腎細(xì)胞癌組織中間充質(zhì)干細(xì)胞生物活性的影響(1)應(yīng)用KN-MSCs和 KC-MSCs,培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的黃芪注射液,用CCK-8法檢測(cè)不同組MSCs的增殖能力。(2)應(yīng)用KN-MSCs和 KC-MSCs,培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的黃芪注射液,檢測(cè)不同濃度黃芪注射液影響下兩種MSCs的成脂肪分化能力和成骨分化能力。(3)應(yīng)用KN-MSCs和 KC-MSCs,培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的黃芪注射液,提取不同組MSCs的總RNA, Realtime-QPCR法檢測(cè)兩種MSCs的部分細(xì)胞因子(IL-8、CCL5、TNF-α、SDF-1、VEGF、PDGF、FGF、EGF、ICMA和N-Cadherin等)的表達(dá)情況。3結(jié)果7例正常腎組織標(biāo)本中有5例成功提取出長(zhǎng)梭狀、貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞；8例腎透明細(xì)胞癌組織標(biāo)本中有6例成功提取出長(zhǎng)梭狀、貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞。兩種細(xì)胞皆形態(tài)均一,傳代至15代以上,形態(tài)無(wú)明顯變化。兩種細(xì)胞增殖曲線皆表現(xiàn)為傳代后第3天進(jìn)入指數(shù)期,第11天進(jìn)入平臺(tái)期。對(duì)兩種細(xì)胞第6代進(jìn)行細(xì)胞周期分析,顯示KN-MSCs中Go/G1期細(xì)胞占93.78%,KC-MSCs中Go/G1期細(xì)胞占93.96%,符合絕大多數(shù)干細(xì)胞處于靜止期的特點(diǎn)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種細(xì)胞第六代的免疫表型,顯示兩種細(xì)胞皆高表達(dá)CD105、CD73和CD90,陽(yáng)性率高于95%；兩種細(xì)胞皆不表達(dá)CD45、CD34和HLADR,陽(yáng)性率低于2%。兩種細(xì)胞均具有向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化的能力。證實(shí)本研究成功地從正常腎組織和腎透明細(xì)胞癌組織中提取出MSCs。應(yīng)用腎透明細(xì)胞癌系(786-0)作細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示空白組和KN-MSCs組腫瘤細(xì)胞遷移能力差異不顯著,KC-MSCs組的腫瘤細(xì)胞遷移能力大于空白組和KN-MSCs組。CCK-8法檢測(cè)三組腎透明細(xì)胞癌株(786-0)的增殖能力,結(jié)果顯示KC-MSCs組的增殖能力大于空白組和KN-MSC組。檢測(cè)三組裸鼠皮下種植瘤的生長(zhǎng)情況,結(jié)果顯示KN-MSCs組和KC-MSCs組的皮下種植瘤體積和重量均大于空白組,KC-MSCs組的皮下種植瘤體積和重量大于KN-MSCs組。提取兩種MSCs的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, Realtime-QPCR法檢測(cè)兩種MSCs的部分細(xì)胞因子(IL-8、CCL5、TNF-α、SDF-1、VEGF、PDGF、FGF、EGF、ICAM-1和N-Cadherin等)的mRNA表達(dá)情況,結(jié)果顯示KC-MSCs對(duì)IL-8和PDGF的表達(dá)能力大于KN-MSCs.加入濃縮的腎透明細(xì)胞癌系(786-0)培養(yǎng)基上清后的KN-MSCs,表達(dá)IL-8和PDGF的能力增強(qiáng)。培養(yǎng)基中加入黃芪后,CCK-8法檢測(cè)KN-MSCs和KC-MSC s的增殖曲線,顯示黃芪組的KN-MSCs和 KC-MSCs增殖能力較強(qiáng)。成脂肪和成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示黃芪組的KN-MSCs 和 KC-MSCs無(wú)明顯成脂肪分化和成骨分化。Realtime-QPCR法檢測(cè)黃芪作用后的MSCs細(xì)胞因子的表達(dá),顯示MSCs對(duì)多種細(xì)胞因子,包括IL-8和PDGF的表達(dá)能力下降。4結(jié)論(1)正常腎組織和腎透明細(xì)胞癌組織中存在MSCs,并可以成功分離、純化。(2)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)顯示,相比來(lái)自正常腎組織來(lái)源的MSCs,腎透明細(xì)胞癌組織來(lái)源的MSCs具有促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌系(786-0)遷移、增殖的能力。(3)腎透明細(xì)胞癌組織來(lái)源的MSCs高表達(dá)IL-8和PDGF,可能是促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制。(4)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞可導(dǎo)致MSCs高表達(dá)IL-8和PDGF。(5)黃芪可以下調(diào)MSCs對(duì)多種細(xì)胞因子,包括IL-8和PDGF的表達(dá)。
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【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.11
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本文編號(hào)：1591604