本文選題：三氧化二砷　切入點：肺腫瘤　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：【研究背景及目的】在全球范圍內(nèi),肺癌是罹患人數(shù)最多的惡性腫瘤,也是導(dǎo)致死亡數(shù)最多的癌癥類別。目前,以放療、化療和分子靶向治療為主的治療雖然具有一定的療效,但由于較高的轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率,長期以來患者的預(yù)后和生存率一直無明顯提高。因此,臨床上迫切需要尋找有效治療肺癌的新策略。近年的研究認(rèn)為腫瘤組織是由異質(zhì)性的細(xì)胞群體構(gòu)成,這些細(xì)胞處于不同的分化階段,具有不同的性質(zhì)和功能,其中有一小部分細(xì)胞具有自我更新能力和多向分化潛能,可以驅(qū)動腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移,對放化療不敏感,這一小部分細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)或腫瘤發(fā)生細(xì)胞。CSCs主宰著腫瘤分化、癌細(xì)胞增殖、自我更新及血管形成等諸多方面,如果能夠有效抑制CSCs,就可以從源頭上阻斷惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。三氧化二砷(arsenic trioxide,As_2O_3)是砒霜的有效成分,在中國有數(shù)千年的用藥歷史。近年來,研究者發(fā)現(xiàn)As_2O_3通過降解PML-RARα融合蛋白,誘導(dǎo)急性早幼粒白血病細(xì)胞干細(xì)胞分化,使患者獲得較高的完全緩解率(65-84%),并且無明顯骨髓抑制等毒副作用,已獲美國FDA批準(zhǔn)用于治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)。Hong等發(fā)現(xiàn)As_2O_3與PI3K抑制劑PI-103聯(lián)合應(yīng)用能減少急性髓性白血病干細(xì)胞的數(shù)量。此外,多項臨床前研究證實As_2O_3可以通過影響與干細(xì)胞功能密切相關(guān)的Hedgehog通路或Notch通路,從而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌及胰腺癌中的CSCs。在肺癌領(lǐng)域,我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)As_2O_3的抗肺癌機(jī)制是多靶點的:As_2O_3可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)肺癌細(xì)胞G1期阻滯;As_2O_3可抑制肺癌血管形成;在動物模型水平,As_2O_3可使腫瘤組織中出現(xiàn)腺腔以及粘液分泌的特異性組織結(jié)構(gòu),降低Ki-67的表達(dá),提示其可能具有誘導(dǎo)肺癌分化的作用。但是目前關(guān)于As_2O_3對肺癌干細(xì)胞的影響尚不清楚。本課題將研究As_2O_3對肺癌干細(xì)胞的影響,并探討可能的作用機(jī)制。【實驗方法】第一部分As_2O_3對肺癌干細(xì)胞的影響一、As_2O_3對肺癌細(xì)胞增殖的影響分別用0、1、2、4、8和16μmol/L的As_2O_3處理肺癌細(xì)胞24、48或72h,利用CCK8試劑盒檢測細(xì)胞增殖活性。二、As_2O_3對肺癌細(xì)胞在體外形成克隆的影響分別用0、1、2和4μmol/L的As_2O_3處理肺癌細(xì)胞72h,隨后每組均取出2×10~3細(xì)胞接種于6孔板,連續(xù)培養(yǎng)2w,觀察克隆形成情況。三、As_2O_3對肺癌細(xì)胞形成腫瘤球的影響分別用0、1、2和4μmol/L的As_2O_3處理肺癌細(xì)胞72h,隨后每組均取出1×10~4細(xì)胞重懸于成球培養(yǎng)液,4-7d后在倒置顯微鏡下觀察并拍照。四、As_2O_3對干細(xì)胞表面標(biāo)志CD133表達(dá)的影響分別用0、1、2和4μmol/L的As_2O_3處理肺癌細(xì)胞72h,進(jìn)行qPCR、Western blot及流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測CD133的表達(dá)情況。五、As_2O_3對干細(xì)胞功能相關(guān)分子Oct4、Sox2、C-myc、nanog、β-catenin及Klf4表達(dá)的影響分別用0、1、2和4μmol/L的As_2O_3處理肺癌細(xì)胞72h,進(jìn)行q PCR和Western blot檢測Oct4、Sox2、C-myc、nanog、β-catenin及Klf4在mRNA及蛋白水平的表達(dá)情況。第二部分As_2O_3對肺癌干細(xì)胞的作用機(jī)制分別用0、1、2和4μmol/L的As_2O_3處理肺癌細(xì)胞72h,進(jìn)行qPCR、Western blot檢測Hedgehog通路的信號分子Ptch、Smo、Gli1、Gli2、N-myc及GAS1在m RNA及蛋白水平的表達(dá)情況�！狙芯拷Y(jié)果】第一部分As_2O_3對肺癌干細(xì)胞的影響一、As_2O_3對肺癌細(xì)胞增殖的影響1、As_2O_3對人肺腺癌細(xì)胞株A549增殖的影響As_2O_3可明顯抑制A549細(xì)胞增殖,且呈時間和劑量依賴性。As_2O_3處理A549細(xì)胞72h,IC_(50)為10.860μM。2、As_2O_3對人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H460增殖的影響As_2O_3可明顯抑制NCI-H460細(xì)胞增殖,且呈時間和劑量依賴性。As_2O_3處理NCI-H460細(xì)胞72h,IC50為5.610μM。3、As_2O_3對人肺鱗癌細(xì)胞株SK-MES-1增殖的影響1、2、4、8或16μmol/L的As_2O_3作用于SK-MES-1細(xì)胞24h、48h或72h均不能顯著抑制SK-MES-1細(xì)胞增殖(P0.05)。4、As_2O_3對人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446增殖的影響As_2O_3可顯著抑制NCI-H446細(xì)胞增殖,且呈時間和劑量依賴性。As_2O_3處理NCI-H446細(xì)胞72h,IC50為4.252μM。二、As_2O_3對肺癌細(xì)胞在體外形成克隆的影響1、As_2O_3對人肺腺癌細(xì)胞株A549在體外形成克隆的影響CCK8結(jié)果提示As_2O_3可明顯抑制A549、NCI-H460和NCI-H446增殖,但SK-MES-1對As_2O_3不敏感,故我們用A549、NCI-H460和NCI-H446進(jìn)行后續(xù)實驗。結(jié)果顯示:在A549細(xì)胞株中,As_2O_3處理組形成的克隆數(shù)與對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2、As_2O_3對人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H460在體外形成克隆的影響2和4μmol/L As_2O_3可明顯抑制NCI-H460細(xì)胞在體外形成克隆(P0.001),而1μmol/L As_2O_3處理組形成的克隆數(shù)與對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3、As_2O_3對人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446在體外形成克隆的影響1、2和4μmol/L As_2O_3均可顯著抑制NCI-H446細(xì)胞在體外形成克隆(P0.001)。三、As_2O_3對肺癌細(xì)胞形成腫瘤球的影響1、As_2O_3對人肺腺癌細(xì)胞株A549形成腫瘤球的影響各As_2O_3處理組形成腫瘤球的數(shù)量與對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。As_2O_3處理組形成腫瘤球的大小與對照組比較也無明顯差別。2、As_2O_3對人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H460形成腫瘤球的影響1、2和4μmol/L As_2O_3均可明顯抑制NCI-H460細(xì)胞形成腫瘤球(P0.001),且隨著As_2O_3作用濃度的增加,這種抑制作用更加明顯。3、As_2O_3對人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446形成腫瘤球的影響1、2和4μmol/L As_2O_3均可明顯抑制NCI-H446細(xì)胞形成腫瘤球(P0.01),且呈濃度依賴性。四、As_2O_3對干細(xì)胞表面標(biāo)志CD133表達(dá)的影響1、As_2O_3對人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H460中干細(xì)胞表面標(biāo)志CD133表達(dá)的影響以上實驗結(jié)果說明As_2O_3對NCI-H460和NCI-H446中的CSCs的抑制效果較明顯。因此,后續(xù)實驗我們僅用NCI-H460及NCI-H446作為研究對象。結(jié)果顯示:1、2和4μmol/L As_2O_3均可下調(diào)NCI-H460細(xì)胞中干細(xì)胞表面標(biāo)志CD133在m RNA及蛋白水平的表達(dá),且呈濃度依賴性。2、As_2O_3對人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446中干細(xì)胞表面標(biāo)志CD133表達(dá)的影響1、2和4μmol/L As_2O_3均可下調(diào)NCI-H446細(xì)胞中干細(xì)胞表面標(biāo)志CD133在m RNA及蛋白水平的表達(dá),且呈濃度依賴性。五、As_2O_3對干細(xì)胞功能相關(guān)分子Oct4、Sox2、C-myc、nanog、β-catenin及Klf4表達(dá)的影響1、As_2O_3對人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H460中干細(xì)胞功能相關(guān)分子Oct4、Sox2、C-myc、nanog、β-catenin及Klf4表達(dá)的影響qPCR結(jié)果提示As_2O_3可使NCI-H460細(xì)胞中Oct4和Sox2 m RNA的表達(dá)明顯下降。但As_2O_3處理組C-myc、nanog、β-catenin及Klf4基因的表達(dá)與對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。western blot結(jié)果提示As_2O_3可抑制Oct4和Sox2蛋白的表達(dá)。2、As_2O_3對人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446中干細(xì)胞功能相關(guān)分子Oct4、Sox2、C-myc、nanog、β-catenin及Klf4表達(dá)的影響qPCR結(jié)果提示As_2O_3可顯著抑制NCI-H446細(xì)胞中Oct4和Sox2 m RNA的表達(dá),且呈濃度依賴性。但As_2O_3處理組C-myc、nanog、β-catenin及Klf4基因的表達(dá)與對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Western blot結(jié)果提示As_2O_3可抑制Oct4和Sox2蛋白的表達(dá)。第二部分:As_2O_3對肺癌干細(xì)胞的作用機(jī)制一、As_2O_3下調(diào)人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H460中Hedgehog通路信號分子的表達(dá)As_2O_3可使NCI-H460細(xì)胞中Hedgehog通路信號分子Smo、Gli1、Gli2、N-myc和GAS1 m RNA及蛋白的表達(dá)明顯下降。但As_2O_3不能影響Ptch受體的表達(dá)。二、As_2O_3下調(diào)人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446中Hedgehog通路信號分子的表達(dá)As_2O_3可使NCI-H446細(xì)胞中Hedgehog通路信號分子Smo、Gli1、Gli2、N-myc和GAS1 mRNA及蛋白的表達(dá)明顯下降。但As_2O_3不能影響Ptch受體的表達(dá)�！窘Y(jié)論】1、As_2O_3可抑制人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H460和人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446中的腫瘤干細(xì)胞。2、As_2O_3通過下調(diào)與肺癌干細(xì)胞功能密切相關(guān)的Hedgehog通路來抑制肺癌干細(xì)胞。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：1587711